穿心莲含量测定 清火栀麦片中穿心莲含量测定的提取条件优化
杨超君+王笑笑+黄芸
[摘要] 意图 根据穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的安稳性机理，结合清火栀麦片的制法，以君药穿心莲主要成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯为目标，优化HPLC法测定清火栀麦片中穿心莲含量的提取条件。 办法 剖析比较不同提取溶剂、提取办法、提取时刻及提取温度对HPLC法测定穿心莲含量成果的影响。 成果 与其他提取溶剂比较，甲醇对穿心莲的提取功率较高，且提取液的杂质含量更低；提取中超声前是否冷浸、加冰或常温对检测成果影响不大；提取时超声1 h较超声30 min的提取作用更好；而在低温时，跟着温度的上升有助于主要成分的提取，但当温度超越60℃时发作降解。 定论 以甲醇为溶媒，常温超声1 h时提取纯度和提取功率较优。
[关键词] 清火栀麦片；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯；甲醇；超声
[中图分类号] R284 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）22-0039-04
[Abstract] Objective To optimize the extraction conditions of HPLC for the determination of andrographis paniculata in Qinghuo Zhimai tablets， based on the stability mechanism of andrographolide and dehydroandrographolide combined with the preparation method of Qinghuo Zhimai tablets， with the indicator of the main ingredient of herbs andrographis including andrographolide and dehydrated andrographolide. Methods The effects of different extraction solvents， extraction methods， extraction time and extraction temperature on the determination of andrographis paniculata by HPLC were analyzed and compared. Results Compared with other extraction solvents， the extraction efficiency of methanol to andrographis paniculata was higher， and the impurity content of the extract was lower. Whether cold dip， adding ice，room temperature or not had little effect on the detection result. The extraction effect of ultrasound for 1 h was better than that of ultrasound for 30 min. While at low temperature， the increase of temperature was helpful to the extraction of the main components， but the degradation occurred when the temperature exceeded 60℃. Conclusion The extraction purity and extraction efficiency were better when using methanol as the solvent at room temperature for 1 h.
[Key words] Qinghuo Zhimai tablets； Andrographolide； Dehydroandrographolide； Methanol； Ultrasound
清火梔麦片是由穿心莲、栀子和麦冬三味药组成，取部分穿心莲和麦冬粉碎成细粉、剩下穿心莲和栀子经水煎煮、浓缩成稠膏，最终参加细粉混匀限制而成的具有清热解毒、凉血消肿成效的中药片剂[1]。其主要成分穿心莲又叫一见喜、苦草、四方草、印度草等，为爵床科植物的枯燥地上部分。味苦、性寒，归心、肺、大肠、膀胱经。《泉州本草》记载其有“清热解毒、消炎退肿，医治咽喉炎、痢疾、高热等成效”，为清热解毒类常用中草药，素有“中药抗生素”的美誉[2，3]。故现清火栀麦片常用于临床咽喉胀痛、急性扁桃体炎、发热、头痛、牙痛、目赤、心火旺盛、睡觉欠安等症状的患者。
跟着清火栀麦片的临床使用，有关其剖析办法的研讨也日益增多。早年其有效成分的测定办法有比色法、分量法等[3]，近年多以薄层扫描法[4，5]、高效液相色谱法（HPLC）等为主[6-9]，此外跟着检测技能的开展新式色谱法以及质谱法等也用于其测定[10， 11]。但因HPLC法专特点强、灵敏度高，含量测定精确且重现性好等长处，HPLC法测定清火栀麦片有效成分的办法研讨较多。其检测多用紫外可见检测器、二极管阵列检测器等[3，12，13]，且跟着剖析办法的进一步探究可一起精确测定2～3种有效成分[14-18]。故本文主要是根据穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的安稳性机理，从提取办法、提取溶媒以及热安稳性的视点动身研讨清火栀麦片中穿心莲含量测定的影响要素。现报导如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪，DAD检测器；UPT-Ⅱ-10T型制水器，成都超纯科技有限公司；Mettler XS-205型电子天平；HH-8数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；KQ5200E型超声波清洗器，作业频率40 kHz，功率200 W，昆山市超声仪器有限公司。endprint
1.2 样品与试剂
清火栀麦片，批号：140505，广西圣特药业有限公司；批号120601，广西金海堂药业有限责任公司；批号：110208，广西圣特药业有限公司；穿心莲内酯，批号0797-200106，含量100%，经五氧化二磷减压枯燥处理12 h以上，中检院供给；脱水穿心莲内酯，批号0854-200204，含量100%，经五氧化二磷减压枯燥处理12 h 以上，中检院供给；除活动相用甲醇为色谱纯，其他均为剖析纯。
2含量测定
2.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C-18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；活动相：甲醇-水（55∶45），流速：1 mL/min；检测波长：穿心莲内酯230 nm，脱水穿心莲内酯250 nm；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
别离精细称取穿心莲内酯19.19 mg和脱水穿心莲内酯15.86 mg制成每1 mL各含38.38 μg和31.72 μg的混合对照品溶液。
2.3含量测定
别离精细汲取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.4提取溶剂的调查
查《我国药典》（2015年版）穿心莲药材、穿心莲片和清火栀麦片含量测定的提取溶剂，再结合蔡松涛等[19]对穿心莲片中含量测定提取溶剂的调查成果，本文在其研讨基础上剖析比较甲醇、70%甲醇与乙醇的提取功率，成果与蔡松涛等[19]的研讨共同：甲醇对穿心莲的提取功率最高，且提取液的杂质含量更低。（1.6805 mg/片>1.5085 mg/片）。
2.5 提取办法与时刻的调查
设定超声提取30 min[1]、超声提取1 h；加冰超声提取30 min、45 min和1 h；先冷浸1 h再超声提取1 h及回流提取1 h[20]作为调查目标。办法：取同批清火栀麦片（140505）20片，去糖衣，称总重，研细，取细粉约0.3 g，精细称定，再精细参加甲醇50 mL，称定分量，按上述各种办法提取，放冷，用甲醇补足减失分量，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按2.3测定。见封三图5、表1。
2.6 提取温度的调查
多个文献报导[21-23]，穿心莲主要成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对热不安稳。特别是在高热[24]（90℃、100℃、110℃、120℃）的情况下，跟着温度的升高，两者的降解速度加重；其间穿心莲内酯跟着温度的升高转化率下降，简直以降解为主，脱水穿心莲内酯的降解速度随温度升高快于穿心莲内酯。结合文献，自己比较了加冰超声、常温超声（不设置温度，水温会随超声时刻的延伸而升高）、40℃、50℃、60℃和70℃恒温超声提取1 h的提取作用。办法：取同批清火栀麦片（140505）细粉约0.3 g，精细称定，再精细参加甲醇50 mL，称定分量，按上述各种办法提取，放冷，用甲醇补足减失分量，过滤，取续滤液作为供试品溶液，按2.3测定。见图1、表1。
3评论
《我国药典》（2015年版）新规范是在2010年版药典和苏建等[21]对清火栀麦胶囊HPLC特征图谱的树立和3种成分测定的基础上树立的新规范，其含量提取办法将提取溶剂更换为70%甲醇，超声功率从本来的250 W，33 kHz更改为250 W，40 kHz，物料比和超声时刻30 min不变。本次试验对提取条件的调查是在2015年版《我国药典》规范的基础上进行改善，希望经过优化提取条件，进一步进步测定的精确性。
一些研讨发现，清火栀麦片中穿心莲主要成分含量跟着储藏时刻的延伸逐步下降。而清火栀麦片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量改变的调查成果[22]也显现，清火栀麦片在温度（40.0±2.0）℃，相对湿度为（75.0±5.0）% 条件下6个月后，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量都发作了改变。其间穿心莲内酯含量跟着时刻相应下降，而脱水穿心莲内酯含量则跟着放置时刻的延伸先添加然后趋于陡峭，但其添加的量与穿心莲内酯降解的量并不成正比，提示在高温下，穿心莲内酯或许一部分转换成脱水穿心莲内酯。此外，一项剖析穿心莲片中穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯变异要素的试验[21]提出，选用新鲜的穿心莲药材，削减药典工艺中的加热时刻和温度等影响要素，是进步穿心莲片质量的有效途径。而清火栀麦片中的有效成分亦为穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯，故可估测加热时刻和温度能够影响其含量测定。而以上成果均提示清火栀麦片中的有效成分存在不安稳性，即提取条件或许影响其测定的精确性。但因清火栀麦片中穿心莲主成分的不安稳性，其提取条件或许影响HPLC法的测定。如颜玉贞[22]報道，穿心莲中的主成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯不安稳，随储藏时刻的延伸部分穿心莲内酯会转化为脱水穿心莲内酯；曾慧芳等[20]报导，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在杂质较少的状况下相对较安稳，在高温加热状况下穿心莲内酯以降解为主，转化为辅；还有何咏梅[21]选用初均速法研讨清火栀麦片中栀子苷的安稳性，发现栀子苷在25℃下降解10%的时刻为1.62年；黄竹英等[18]选用加快安稳性试验法研讨清火栀麦片的安稳性，发现放置6 个月之后栀子苷含量无明显差异，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量则均下降，并指出清火栀麦片不适宜存放于高温高湿环境。
故本文结合相关试验研讨，经过对提取溶剂、提取办法、提取时刻以及提取温度的比较，对清火栀麦片中穿心莲含量测定的提取条件进行优化。查阅文献发现，HPLC法测定清火栀麦片中穿心莲含量时的提取溶剂包含乙醇、70%乙醇、50%乙醇和甲醇等[4-8]，而周国儿等[6]研讨显现70%乙醇较50%乙醇提取作用好，故咱们挑选乙醇、70%乙醇和甲醇作为提取溶剂别离试验，成果发现甲醇对穿心莲的提取功率最高，且提取液的杂质含量更低。然后咱们归纳以往研讨中的不同提取办法[4-8]，挑选比较超声提取、先冷浸再超声提取和加热回流提取三种不同提取办法，成果发现，先冷浸再超声较直接超声的提取功率稍高，但无明显差异；而加热回流提取的功率较超声和先浸再超法明显下降，故穿心莲的提取挑选直接超声法即可。但不同提取办法时（冷超和热超），超声提取1 h的功率均较30 min好，故提取1 h的时刻或许更为合理。穿心莲的安稳性试验成果[19-22，24]提示，穿心莲主要成分对热不安稳，特别是在高热时会跟着温度的升高加快降解。故咱们比较了加冰、常温、40℃、50℃、60℃和70℃等不同温度下超声1h的提取功率，成果发现，加冰和常温超声的提取作用较好，在低温（<60℃）的情况下，跟着温度的上升有助于主要成分的提取，但当温度超越60℃时提取功率下降。提示提取温度过高时清火栀麦片主要成分或许发作降解，且该成果或许提示了穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯热降解动力学的温度拐点。endprint
综上，甲醇常温超声1 h为清火栀麦片中穿心莲含量测定的适宜提取条件。
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（收稿日期：2017-04-21）endprint