单核苷酸多态性 CD40基因单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化阻塞症的相关性研讨
周玉斌 汤海涛 吴丹明
[摘要] 意图 评论CD40基因单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化阻塞症的相关性。 办法 选用reverse transcription-PCR技能及DNA测序法对经动脉五颜六色多普勒查看确诊为下肢动脉硬化阻塞症的201例患者（病例组）及健康体检中未发现下肢动脉硬化阻塞症的198例健康人（对照组）进行检测剖析，比较CD40基因rs1883 832C/T单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化阻塞症的相关性。 成果 下肢动脉硬化阻塞症组与健康对照组CD40基因rs1883832C/T位点中CC基因比较，差异有统计学含义（χ2=7.380，P=0.007）；经过等位基因频率的风险性评价发现，C基因携带者患下肢动脉硬化阻塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。 定论 CD40基因多态性位点rs1883832C/T与下肢动脉硬化阻塞症的发病明显相关，其间C等位基因或许是该疾病的风险要素。
[关键词] 基因；等位基因；动脉粥样硬化；单核苷酸多态性
[中图分类号] RR543.5；R440 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0026-03
[Abstract] Objective To investigate the correlation between single nucleotide polymorphisms of CD40 gene as well as its genotype and arteriosclerosis obliterans of lower extremities. Methods 201 patients who were diagnosed with arteriosclerosis obliterans by arterial color Doppler ultrasonography examination（case group） and 198 cases of healthy patients who were not found lower extremity arteriosclerosis obliterans in health examination（control group） were detected and analyzed by use of reverse transcription-PCR and DNA sequencing. The correlation between CD18 gene rs1883832C/T single nucleotide polymorphisms as well as their genotype and lower extremity arteriosclerosis obliterans were compared. Results CC gene in CD40 gene rs1883832C/T locus of the case group was significantly different from that of the control group（χ2=7.380， P=0.007）. Through the risk assessment of allele frequency， it was found that the risk of atherosclerotic occlusive disease in C gene carriers was 1.304 times that of T gene carriers（OR=1.304）. Conclusion CD40 gene polymorphic locus 1883832C/T was significantly associated with the development of lower extremity arteriosclerosis obliterans， in which C allele may be a risk factor for the disease.
[Key words] Gene； Allele； Atherosclerosis； Single nucleotide polymorphism
下肢動脉硬化阻塞症是全身动脉粥样硬化在下肢动脉的体现，是反响全身动脉粥样硬化的一个窗口，一般发作在40岁以上人群中，跟着年纪添加而逐步加剧[1]，常因动脉内膜增厚、管腔狭隘或阻塞导致间歇性跛行、患肢皮温低、痛苦乃至发作溃疡或肢体坏死[2]。近年来，越来越多的研讨显现，动脉粥样硬化是动脉内膜发作了炎症性质的改动，而CD40基因能够对炎症反响进行激活，然后促进动脉内膜的炎症改动的发作[3，4]，为了评论CD40基因与下肢动脉硬化阻塞症之间的联络，本文选用reverse transcription-PCR技能及DNA测序法对201例下肢动脉硬化阻塞症患者及198例健康人进行检测，经过对两组人群进行比较，评论 CD40基因单核苷酸多态性及其基因型与下肢动脉硬化阻塞症的相关性，为基因与表型之间的联络供给实际根据，为进一步研讨下肢动脉硬化阻塞症的发病机制供给线索。
1材料与办法
1.1一般材料
挑选2014年1月～2016年5月间于我院住院就诊的下肢动脉硬化阻塞症的201例患者为病例组，其间男123例，女78例，平均年纪（63.2±15.1）岁，另挑选2015年5月～2015年8月间来我院健康体检的40岁以上健康人198例为对照组，其间男105例，女93例，平均年纪（64.7±18.3）岁。病例组与对照组在年纪、性别等方面均衡可比。
1.2归入及扫除规范
归入规范：病例组患者均契合2011年卫生部公布的下肢动脉硬化阻塞症确诊规范（WS 339-2011），一切归入的人群均不兼并血管栓塞性疾病、血管炎性疾病及肿瘤、自身免疫性疾病；扫除规范：发作过血栓阻塞性脉管炎、多发性大动脉炎、结节性动脉周围炎、特发性动脉血栓构成以及急性下肢动脉栓塞的患者；回绝进行本次研讨的患者。
1.3研讨办法
选用reverse transcription-PCR技能及DNA测序法检测意图基因的多态性。
1.3.1 RNA的提取 在查询目标全血中搜集单个核细胞，选用改进酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法（TRIzol法）提取单核细胞基因组RNA[5]，然后将提取的RNA反转录成c-DNA保存于-80℃冰箱中备用。
1.3.2 引物的规划 选用primer premier5引物规划软件规划CD40基因rs1883832C/T基因序列的扩增引物。首先在NCBI的基因库中查找该基因的基因序列，仿制序列至primer premier5软件，设置参数，引物长度一般设置成18～30 bp，扩增片段长度设置成100～600 bp。规划完成后选用Oligo 6.0软件对引物进行验证评价。
1.3.3 引物的组成 选用分子量规范引物定位组成法（marker primer-directed synthesis，MPDS）[6]组成以上软件规划的引物，其间，rs1883832C/T位点碱基的DNA片段正向引物序列为5-GGACCTGGGGG-CAAAGAAGA-3，反向引物序列为5-CCCACTCCCAAC-TCCCGTCT -3。
1.3.4 PCR扩增 该CD40基因单核苷酸的PCR扩增系统共50 μL，详细反响系统成分及扩增程序见表1、2。CD40基因单核苷酸多态性分型用Genemapper4.0进行剖析。
1.4统计学办法
CD40基因各多态性位点基因型和等位基因频率选用直接计数法核算，病例组与对照组两组之间基因型及等位基因频率的比较选用χ2查验，关于其间单个基因是否是导致该病的风险要素选用OR（比值比）进行核算，OR值>1标明该要素是风险要素；OR值<1，标明该要素是维护要素。选用SPSS19.0软件对数据进行核算和比较，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 CD40基因单核苷酸多态性位点基因型
CD40基因rs1883832C/T位点PCR扩增产品片段巨细为374 bp。根据单核苷酸多态性分型成果，CD40基因单核苷酸多态性位点基因型均为CC型、CT型以及TT型。
2.2 病例组与对照组CD40基因多态性的差异
经过Hardy-Weinberg遗传平衡规律查验，本试验所归入的两组人群中CD40基因型散布频率与实际人群散布共同，处于遗传平衡状况，具有集体代表性。下肢动脉硬化阻塞症组与健康对照组CD40基因rs1883832C/T位点，CC、TT基因型和C、T等位基因频率比较，差异具有统计学含义（P<0.05）。其间，C基因携带者患下肢动脉硬化阻塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。见表3。
3 评论
隨着年纪的添加，下肢动脉硬化阻塞症的发病率逐年进步，带给人们的健康损害也越来越大。据报道，国外75岁以上人群中患病率挨近20%[7-9]，在我国，晚年人群中下肢动脉硬化阻塞症的患病率高达10% 以上[10]。一起，相应的流行病学查询显现，在进行下肢截肢的患者中约有40%～60%是因为发作了下肢动脉硬化阻塞症[11]，即使能够保存下肢，关于下肢动脉硬化阻塞症的患者而言，其自己自身的日子质量也不高。因而，关于下肢动脉硬化阻塞症的病因学研讨也显得更加剧要。越来越多的有关动脉硬化相关疾病与基因间的联络的研讨证明基因层面的病因才是导致该疾病发作的主要原因[12]。而进行年来，越来越多的研讨标明构成动脉粥样硬化的最主要原因是因为缓慢炎症性质的改动，在最近的基因与疾病的相关性研讨中，有学者研讨发现，表达多种细胞的肿瘤坏死因子受体超家族成员CD40的多态性与血管硬化性疾病的发作具有相关性，以往的研讨显现正常的动脉内并不存在CD40L，仅仅只存在CD40，但是在存在着动脉粥样硬化内皮细胞中CD40L与CD40均存在。而进一步的研讨证明，一旦坐落血管滑润肌内的CD40L被激活，会使得细胞外间质胶原纤维的降解增大，然后使得动脉血管内斑块的不稳定性添加，进一步加快下肢动脉硬化阻塞症的发作[13]。
本病例对照研讨中，下肢动脉硬化阻塞症组在rs1883832C/T位点上CC等位基因的频率要明显高于与健康对照组（P<0.05）。一起，咱们发现rs1883832C基因携带者患下肢动脉硬化阻塞症的风险是T基因携带者的1.304倍（OR=1.304）。上述研讨成果标明：CD40基因多态性位点rs1883832C/T与下肢动脉硬化阻塞症的发病明显相关，其间C等位基因或许是该疾病的风险要素。这一研讨成果也与国表里相关的研讨成果相印证。国内学者的研讨发现，CD40的多态性可影响CD40基因及蛋白表达，进而关于CD40相关疾病的开展和转归都能发作相应的影响[12]，结合本次试验成果，咱们以为CD40基因rs1883832C/T位点C基因在下肢动脉硬化阻塞症的发病中起到重要作用， C等位基因或许经过促进CD40基因多态性的表达而促进下肢动脉硬化阻塞症的发病。在现代的研讨中相关的学者现在在动脉粥样硬化的基础研讨中现已达到一致，即动脉粥样硬化为“炎症损害反响”机制下的一个产品。而CD40能够经过关于MCP-1的表达进行上调，然后促进血管滑润肌的细胞分裂增殖，一起还能使本来处于停止状况的坐落中层的滑润肌细胞进行搬迁，往内膜处进行搬迁，终究构成纤维性斑块。一起CD40不断的添加炎症因子的开释，导致了血管内皮的损害，而且发作堆积反响，终究激活CD40基因，使得免疫细胞很多的集合，发作一系列相关的反响后终究导致了动脉粥样硬化的构成[14，15]。
本研讨成果提示CD40基因多态性与下肢动脉硬化阻塞症之间具有相关性，但基因与该疾病之间的详细分子生物学机制以及CD40基因在下肢动脉硬化阻塞症发病中所占的比重依然不知道，要真实搞清这些问题，在基因角度上提出疾病防备的根据，依然需求大样本、多中心的随机对照研讨的印证。
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（收稿日期：2016-09-17）