放疗为什么死得更快 BIX—01294靶向组蛋白甲基转移酶G9a在小细胞肺癌患者中的应用研究
王丹丹 朱丹燕 王丹 徐文震
[摘要] 意图 探討BIX-01294靶向组蛋白甲基搬运酶G9a在小细胞肺癌患者中的使用。 办法 挑选2016年2～8月医院收治的小细胞肺癌患者50例，患者均行手术医治，取小细胞肺癌病灶标本及相应癌旁正常安排标本，选用HE染色及免疫组化染色检测两种不同标本中BIX-01294靶向组蛋白甲基搬运酶G9a表达状况。 成果 50例小细胞肺癌患者中，29例发作淋巴或远处搬运，21例未发作搬运。50例肿瘤相应癌旁3 cm以上的肺安排均为正常安排。G9a按捺剂BIX-01294在两种安排阳性表达率比较差异有统计学含义（P<0.05）；小细胞肺癌G9a按捺剂BIX-01294表达水平与临床分期、肿瘤分级联系密切（P<0.05）；G9a按捺剂BIX-01294在小细胞肺癌癌旁安排及小细胞肺癌中均有表达，首要会集在细胞质中，细胞膜及细胞核中也有表达，免疫组化颗粒呈棕黄色。小细胞肺癌安排中29份标本呈阳性表达，50例癌旁安排中，14例阳性表达。 定论 G9a按捺剂BIX-01294在小细胞肺癌安排中表达上调，能调控小细胞肺癌患者Wnt信号通路。
[关键词] 小细胞肺癌；DNA反常甲基化；组化蛋白；Wnt信号通路；BIX-01294靶向组蛋白甲基搬运酶G9a
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）04-0001-04
Study on the application of BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a in the patients with small cell lung cancer
WANG Dandan1 ZHU Danyan1 WANG Dan1 XU Wenzhen2
1.Department of Pharmacy， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， Taizhou 318000， China； 2.Department of Thoracic Surgery， Sanmenwan Branch， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University， Sanmen 317100， China
[Abstract] Objective To investigate the application of BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a in small cell lung cancer. Methods From February to August 2016， 50 patients with small cell lung cancer who were admitted to our hospital were selected. Patients were given surgical treatment. Small cell lung cancer specimens and the corresponding adjacent normal tissue specimens were collected. The expression of BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a in two different specimens was detected by HE staining and immunohistochemical staining. Results Of the 50 patients with small cell lung cancer， 29 patients had lymphatic or distant metastases and 21 had no metastases. In 50 cases of tumor， the lung tissues adjacent to the cancer 3 cm and above were normal tissues. The positive expression rate of G9a inhibitor BIX-01294 in two tissues was compared， and the differences were statistically significant（P<0.05）； the expression level of G9a inhibitor BIX-01294 in small cell lung cancer was closely related to clinical staging and tumor classifications（P<0.05）； G9a inhibitor BIX-01294 in paracancerous tissues of small cell lung cancer and small cell lung cancer was expressed， mainly concentrated in the cytoplasm. It was also expressed in cell membrane and nucleus， and immunohistochemical particles were brown. In the small cell lung cancer tissues， 29 specimens were positively expressed. In 50 cases of paracancerous tissue， 14 cases were positively expressed. Conclusion G9a inhibitor BIX-01294 is up-regulated in small cell lung cancer and can regulate Wnt signaling pathway in small cell lung cancer.
[Key words] Small cell lung cancer； DNA aberrant methylation； Immunohistochemical protein； Wnt signaling pathway； BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a
肺癌是临床上常见的恶性肿瘤，我国肺癌每年发病人数超越100万，而且以每年26.9%的速度迅速增长，尽管临床关于肺癌技能的医治取得了较大的开展，可是患者5年生存率低于15%。因而，肺癌现已替代肝癌成为恶性肿瘤逝世的首要原因[1]。根据病理特征不同，临床大将肺癌分为两类：非小细胞肺癌（包含肺腺癌、肺鳞癌、大细胞肺癌）和小细胞肺癌[2]。小细胞肺癌占肺癌的20.0%～25.0%，可是具有恶性程度最高、分解最低的一类肿瘤。现在，临床上关于肺癌发病机制尚不彻底知晓，多与吸烟、环境污染等有关，且跟着环境污染的加剧，导致小细胞肺癌发作率呈现上升及年轻化趋势，严重影响我国居民健康[3]。
组蛋白润饰是指发作在组蛋白氨基酸残基上一系列化学润饰，首要包含乙酰化、甲基化、磷酸化等[4]。而组蛋白润饰则是表性遗传的一种首要机制，在多种肿瘤的发作、开展中发挥了重要的效果[5]。G9a是一种组蛋白甲基化搬运酶，首要担任常染色质区域蛋白H3中K9及K27位点的甲基化[6]。G9a能够通过两种不同的机制完结基因转录的调控，一方面能促进基因启动子区域组蛋白或DNA甲基化，能有效地甲基化。而G9a能作为脚手架蛋白进一步激活转录因子，然后能促进基因的转录[7]。文献报导显现[8]，BIX-01294靶向组蛋白甲基搬运酶G9a能直接参加肿瘤的发作、开展，可是该机制尚不彻底知晓。为评论BIX-01294靶向组蛋白甲基搬运酶G9a在小细胞肺癌患者中的使用，取2016年2～8月医院收治的小细胞肺癌患者50例，现报导如下。
1 材料与办法
1.1 临床材料
挑选2016年2～8月医院收治的小细胞肺癌患者50例，男31例，女19例，年纪39～79岁，均匀（60.14±4.21）岁。肿瘤安排病理分级：高分解23例，中分解12例，低分解15例。TNM分期： Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期28例。29例发作淋巴或远处搬运，21例未发作搬运。归入规范：①契合小细胞肺癌临床确诊规范；②均通过手术病理查看终究确诊为小细胞肺癌；③患者均行手术医治，术中取病灶安排及癌旁安排；④对本课题知情赞同，自愿签署知情赞同书。扫除规范：①扫除不契合小细胞肺癌临床确诊规范者；②扫除兼并有影响效应目标观测、判别其他生理或病理者；③扫除兼并因为电解质紊乱以及酸碱平衡失调引起的心律失常。不同患者性别、年纪、肿瘤安排病理分级及TNM分期比较差异无统计学含义。
1.2首要仪器与试剂
为确保试验顺利完结，选用的首要仪器和试剂首要由倒置相差显微镜（Leica，Germany ）、兔抗人G9a抗体（美国 Upsate 公司）、Ultrasensitive TMS-P试剂盒（福州迈新生物有限公司）、白腊切片机（德国 Leica RM2016）、数码医学图画剖析体系（德国Motic Med 6.0B）、电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、DAB显色试剂盒（中杉公司）等。
1.3 办法
选用HE染色及免疫组化染色检测两种不同标本中BIX-01294靶向组蛋白甲基搬运酶G9a表达状况。对每一例病理标本接连制备3张4 μm切片，并进行染色。抗G9a抗体稀释浓度为1：100，PBS替代一抗作为对照。（1）HE染色。取新鲜的病灶安排及癌旁安排，放入10.0%中性甲醛溶液中固定，惯例脱水、通明，滋润包埋后处理，选用切片机制备4 μm切片，HE染色，倒置显微镜下调查细胞的形状[9，10]。（2）免疫组化染色。制备4 μm白腊切片，选用二甲苯脱蜡、乙醇水化，使用高压锅高温、高压下进行抗原修正，天然冷却后水洗选用PBS在pH为7.4下进行漂洗，滴加50 μL兔抗人G9a抗体，放入4℃冰箱中过夜，选用PBS进行冲抵，滴加50 μL二抗（酶标抗兔聚合物）在37℃孵育，选用PBS进行3次冲刷，参加DAB显色剂显色，使用自来水进行漂洗，苏木精衬染及蓝花，梯度乙醇脱水后，二甲苯通明，中性树脂胶封片，倒置显微镜下调查细胞形状[11，12]。
1.4 判别规范
（1）HE染色。选用单盲法对病理学进行复查，确诊为小细胞肺癌，并进行病理分级。（2）G9a按捺剂BIX-01294免疫组化表达判别规范。对病灶安排与癌旁安排选用二级积分法进行断定[13]。①根据染色规模进行积分。上色规模<1%记为0分，1%～19%记1分，20%～50%记2分，>50%记3分；②根据上色程度进行评分。无上色记0分，较浅记1分，较深上色记2分。将两种评分相加作为总计分。总得分≤1.9分为阴性（-），2.0～2.9分弱阳性（+），3.0～3.9分为阳性（2+），≥4.0分为强阳性[14，15]。
1.5 统计学剖析
选用SPSS18.0统计学软件处理，计数材料以[n（%）]表明，选用χ2查验，计量材料以（x±s）表明，选用t查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 50例小細胞肺癌患者HE染色成果
50例小细胞肺癌患者中，29例发作淋巴或远处搬运，21例未发作搬运。50例肿瘤相应癌旁3 cm以上的肺安排均为正常安排。
2.2 G9a按捺剂BIX-01294在小细胞肺癌安排及正常安排中的表达
G9a按捺剂BIX-01294在50例胃癌患者中29例阳性表达，21例表达缺失，阳性表达率为58.0%。而在50例癌旁安排中，14例阳性表达，36例表达缺失，阳性表达率为28.0%，两种安排阳性表达率比较差异有统计学含义（P<0.05），见封三图1。
2.3 小细胞肺癌G9a按捺剂BIX-01294表达水平与临床分期、肿瘤分级的相关性
小细胞肺癌G9a按捺剂BIX-01294表达水平与临床分期、肿瘤分级联系密切（P<0.05），见表1。
表1 小细胞肺癌G9a按捺剂BIX-01294表達水平与临床分期、肿瘤分级的相关性
2.4 小细胞肺癌G9a按捺剂BIX-01294表达水平免疫组化染色成果
G9a按捺剂BIX-01294在小细胞肺癌癌旁安排及小细胞肺癌中均有表达，首要会集在细胞质中，细胞膜及细胞核中也有表达，免疫组化颗粒呈棕黄色。小细胞肺癌安排中29份标本呈阳性表达，50例癌旁安排中，14例阳性表达，见封三图2。
3评论
肺癌是临床上常见的恶性肿瘤，根据WHO最新报导，2015年全世界每年有640万人死于肺癌，比2005年增加了100万。我国每年肺癌新增例数超越100万，成为世界上“肺癌榜首大国”。临床根据肺癌的病理特征不同将其分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌[16，17]。前者又分为肺腺癌、肺鳞癌及大细胞肺癌。数据报导显现，小细胞肺癌仅占肺癌的20.0%～25.0%，是肺癌中恶性程度最高、分解最低的恶性肿瘤。流行病学调查研讨显现[18]，小细胞肺癌发病年纪在30～70岁之间，且男性多于女人，起源于支气管黏膜或腺上皮内的Kulchitsky细胞，具有必定的神经内分泌功用。
组蛋白甲基化是染色质结构改动和基因转录的重要调控机制，多于肿瘤的发作、开展有关。组蛋白甲基化搬运酶是一类催化1～3个甲基基团搬运到组蛋白赖氨酸或精氨酸上的酶[19，20]。而G9a归于含SET结构的Suv39h蛋白宗族成员之一，归于小细胞肺癌中比较重要的常染色质HMT，在肺癌的发作、开展中发挥重要的效果。本研讨中，50例小细胞肺癌患者中，29例发作淋巴或远处搬运，21例未发作搬运。50例肿瘤相应癌旁3 cm以上的肺安排均为正常安排。从大的视点来说，G9a又称为常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基搬运酶-2，在哺乳动物中相对保存。数据报导显现，人源、牛源、大鼠与小鼠G9a同源性高达95.0%。而小鼠G9a的N端含谷氨酸和半胱氨酸区域，或许参加G9a本身的甲基化。一起，G9a在多种安排中表达[21]。相关学者对正常不同小鼠G9a表达进行测定，成果显现：G9a在肌肉、心脏、脑等安排中存在高表达，而在白色脂肪、脾脏及肺部安排中表达相对较低。当机体肺部安排发作反常后，G9a水平将会呈现上升趋势[22]。本研讨中，G9a按捺剂BIX-01294在50例胃癌患者中29例阳性表达，21例表达缺失，阳性表达率为58.0%。而在50例癌旁安排中，14例阳性表达，36例表达缺失，阳性表达率为28.0%，两种安排阳性表达率比较差异有统计学含义（P<0.05）。
G9a按捺剂BIX-01294是继Suv39h1后发现的第2个哺乳动物中甲基化赖氨酸的HMT，能直接效果在H3K9和K27等位点[23]。一起，G9a按捺剂BIX-01294能将甲基从SAM搬运到意图氨基上，然后能有效地按捺基因的转录。一起，G9a按捺剂BIX-01294与GLP联系密切，人源G9a按捺剂BIX-01294与GLP的类似度到达45.0%。此外，G9a按捺剂BIX-01294不仅能调控组蛋白的甲基化，还能调控DNA甲基化程度，而且能在DNA甲基搬运酶的效果下呈现高表达。本研讨中，小细胞肺癌G9a按捺剂BIX-01294表达水平与临床分期、肿瘤分级联系密切（P<0.05）。由此看出：G9a按捺剂BIX-01294在小细胞肺癌中具有高表达，而且其表达水平与肿瘤的临床分期、肿瘤的分级等有关。因而，小细胞肺癌患者医治过程中应该加强G9a按捺剂BIX-01294水平监测，根据监测成果调整医治计划，使得患者的医治更具针对性[24]。本研讨中，G9a按捺剂BIX-01294在小细胞肺癌癌旁安排及小细胞肺癌中均有表达，首要会集在细胞质中，细胞膜及细胞核中也有表达，免疫组化颗粒呈棕黄色。小细胞肺癌安排中29份标本呈阳性表达，50例癌旁安排中，14例阳性表达。文献报导显现：G9a按捺剂BIX-01294能有效地促进肿瘤的发作、开展，能继续引发自噬，然后引起癌细胞的增殖和分解，而且G9a按捺剂BIX-01294能座位癌细胞自噬诱导剂，能为癌症的医治供给新的思路和办法[25]。
综上所述，G9a按捺剂BIX-01294在小细胞肺癌安排中表达上调，能调控小细胞肺癌患者Wnt信号通路，直接参加肿瘤的发作、开展，加强G9a按捺剂BIX-01294监测能为临床医治供给根据和参阅。
[参阅文献]
[1] Kim Y，Kim YS，Kim DE，et al.BIX-01294 induces autophagyassociated cell death via EHMT2/G9a dysfunction and intracellular reactive oxygen species production[J]. Autophagy，2013，9（12）：212621-212639.
[2] 冯兵，朱莹，贺嵩敏，等.罗勒多糖对缺氧条件下肝癌细胞组蛋白H3K9me2甲基化及G9a、JMJD1A表达的影响[J].中药材，2015，38（7）：1460-1465.
[3] 李青云，郝亚荣，秦健，等.BIX-01294对肝癌细胞增殖才能的影响[J].中华肿瘤防治杂志，2016，23（8）：487-492.
[4] Ding J，Li T，Wang X，et al.The histone H3 methyltransferase G9A epigenetically activates the serine-glycine synthesis pathway to sustain cancer cell survival and proliferation[J].Cell Metab，2013，18（6）： 896-907.
[5] 张真真，杨娇娇，居玲莎，等.组蛋白甲基搬运酶 G9a 在七氟醚致乳鼠远期认知功用损害中的效果[J].临床麻醉学杂志，2016，32（9）：901-904.
[6] 薛伟丽，孙瑜，郑凌.组蛋白甲基化搬运酶G9a的最新研讨进展[J].生命科学仪器，2015，14（2）：23-29.
[7] 杜漸，谭广，罗海峰，等.下调组蛋白甲基搬运酶EZH2对人胰腺癌细胞RUNX3基因表达及增殖、凋亡的影响[J].中华肝胆外科杂志，2016，22（4）：249-252.
[8] 刘奔，张熙凝，陈可欣.组蛋白赖氨酸甲基搬运酶SET8对蛋白的甲基化润饰及与肿瘤相关性的研讨进展[J].我国肿瘤临床，2015，42（15）：765-769.
[9] Oyer JA，Huang X，Zheng Y，et al.Point mutation E1099K in MMSET/NSD2 enhances its methyltranferase activity and leads to altered global chromatin methylation in lymphoid malignancies[J]. Leukemia，2014，28（1）：198-201.
[10] 齐琳洁，袁媛，黄璐琦，等.金银花组蛋白甲基搬运酶基因生物信息学及表达剖析[J].我国中药杂志，2015，40（11）：2062-2067.
[11] 亢盼，李向阳，牛侨.亚缓慢铝露出对大鼠学习回忆才能及组蛋白H3K4甲基搬运酶影响研讨[J].我国工作医学，2015，42（5）：510-515.
[12] 崔昂，崔龙.组蛋白三甲基搬运酶SETD2与肿瘤发作开展的联系[J].我国肿瘤生物医治杂志，2016，23（1）：119-123.
[13] 孙芳，潘云，李艳.组蛋白润饰在常见血液体系肿瘤中效果的研讨进展[J].我国试验血液学杂志，2015，23（4）：1184-1189.
[14] 郇通，潘云，李艳.NSD宗族组蛋白甲基化搬运酶与肿瘤发作[J].我国细胞生物学学报，2015，35（5）：728-733.
[15] Shiba N，Ichikawa H，Taki T，et al.NUP98-NSD1 gene fusion and its related gene expression signature are strongly associated with a poor prognosis in pediatric acute myeloid leukemia[J].Genes Chromosomes Cancer，2013，52（7）：683-693.
[16] Akiki S，Dyer SA，Grimwade D，et al.NUP98-NSD1 fusion in association with FLT3-ITD mutation identifies a prognostically relevant subgroup of pediatric acute myeloid leukemia patients suitable for monitoring by real time quantitative PCR[J]. Genes Chromosomes Cancer，2013，52（11）：1053-1064.
[17] Yang S，Zhang Y，Meng F，et al.Overexpression of multiple myeloma SET domain（MMSET） is associated with advanced tumor aggressiveness and poor prognosis in serous ovarian carcinoma[J]. Biomarkers，2013，18（3）：257-263.
[18] Ezponda T，Popovic R，Shah MY，et al. The histone methyltransferase MMSET/WHSC1 activates TWIST1 to promote an epithelial-mesenchymal transition and invasive properties of prostate cancer[J]. Oncogene，2013，32（23）：2882-2890.
[19] Kuo CH，Chen KF，Chou SH，et al.Lung tumor-associated dendritic cell-derived resistin promoted cancer progression by increasing Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1/Twist pathway[J].Carcinogenesis，2013，34（11）：2600-2609.
[20] 刘腾，瞿鑫兰，王子一，等.多氯联苯露出对着床期子宫内膜安排中组蛋白甲基化搬运酶的影响[J].武汉大学学报（医学版），2015，36（6）：849-852.
[21] 关景云，杨阳，邱春红，等.组蛋白乙酰搬运酶MOF在多发性硬化发病机制中的效果[J].山东大学学报（医学版），2016，54（2）：27-32.
[22] 李智佳，章海波，柳树，等.肺癌mdig基因对组蛋白H3及H4部分位点赖氨酸残基甲基化状况的效果[J].我国当代医药，2016，23（20）：11-14.
[23] 韦秀望，易晓明，唐朝朋，等.肾细胞癌安排中的组蛋白甲基化酶表达及其临床含义[J].医学研讨生学报，2015，28（10）：1048-1052.
[24] 董杰，王龙信，唐朝朋，等.转化生长因子β不灵敏的树突状细胞疫苗对肾细胞癌荷瘤小鼠细胞毒性T淋巴细胞的影响[J].医学研讨生学报，2013，26（5）：455-459.
[25] 唐朝朋，徐振宇，周文泉，等.加快恢复外科在后腹腔镜肾上腺切除术中的使用[J].医学研讨生学报，2014，27（8）：829-832.
（收稿日期：2016-12-06）