唾液腺腺样囊性癌 唾液腺腺样囊性癌中Runx3的表达及临床意义
许正元+何剑锋
[摘要] 意图 评论唾液腺腺样囊性癌（SACC）中Runx3的表达及与临床病理要素的相关性。 办法 选用荧光定量RT-PCR检测Runx3在6例SACC安排及正常唾液腺安排中的表达。免疫组化检测58例SACC和正常唾液腺安排中Runx3蛋白的表达。选用SPSS17.0软件包剖析Runx3的表达程度与临床病理要素之间的相关性。 成果 qRT-PCR的丈量显现唾液腺腺样囊性癌中Runx3 mRNA表达显着下调。免疫组化成果显现，Runx3在SACC中的表达与病理类型（实体型）、T临床分期及淋巴结搬运明显相关，而与肿瘤远处搬运存在弱相关。 定论 Runx3表达下调与SACC发作开展相关，或许是临床确诊和医治SACC的重要生物标志物。
[关键词] Runx3；唾液腺；腺样囊性癌；RT-PCR
[中图分类号] R739.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）25-0001-03
Expression and clinical significance of Runx3 in salivary adenoid cystic carcinoma
XU Zhengyuan1 HE Jianfeng2
1.Department of Stomatology， Changxing Hospital of Traditional Chinese Medicine in Zhejiang Province， Changxing 313100， China； 2.Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Medical College in Zhejiang University， Hangzhou 310000， China
[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression of Runx3 and the clinical pathologic factors in salivary adenoid cystic carcinoma （SACC）. Methods The fluorescent quantitation RT-PCR was used to detect the expression of Runx3 in 6 cases of SACC tissues and normal salivary gland tissues. The immunohistochemistry was used to detect the expression of Runx3 protein in 58 cases of SACC and normal salivary gland tissues. The SPSS 17.0 software package was used to analyze the correlation between the expression degree of Runx3 and the clinical pathological factors. Results The qRT-PCR measurement showed that the expression of Runx3 mRNA reduced significantly in SACC. The immunohistochemical results showed that the expression of Runx3 in SACC was significantly correlated to the pathological pattern（entity type）， T clinical stage and lymph node metastasis， but was slightly correlated to the distant metastasis of tumors. Conclusion Runx3 expression downregulation is correlated to the occurrence and development of SACC， which can be an important biomarker for the clinical diagnosis and treatment of SACC.
[Key words] Runx3； Salivary gland； Adenoid cystic carcinoma； RT-PCR
人类Runt相关转录因子-3（runt related transcription factor 3，Runx3）坐落人染色体1p36上，该基因或蛋白的表达缺失是多种恶性肿瘤发作和开展的内涵原因[1]，也是肿瘤侵袭和远处搬运的重要调控因子[2-6]，在肿瘤的前期发作中具有重要的调控效果[7，8]。唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）约占唾液腺上皮性肿瘤的10%，具有部分高侵袭性和易沿神经侵略的临床特色，而且简单侵略血管，导致较高的远处搬运率。因而，评论Runx3在唾液腺腺样囊性癌中的表达对判别肿瘤发作和发展及预后将有必定的参阅效果。本试验中，咱们经过别离运用qRT-PCR和免疫组化丈量涎腺腺样囊性癌（SACC）和正常唾液腺安排中Runx3 mRNA和蛋白的表达，并经过比较Runx3的表达水平与临床要素和病理之间的相关性，然后评论Runx3在SACC中的临床价值和确诊价值。
1 资料及办法
1.1 资料
选取2007年1月～2013年12月档案库中58例白腊包埋的唾液腺腺样囊性癌标本，并依据WHO腺样囊性癌确诊规范从头承认病理成果（SACC组）。其中男40例，女18例；年纪25～83岁，均匀51.5岁。选取6例配对-80℃保存的腺样囊性癌安排和正常腺体安排进行基因水平的检测。
1.2 办法
1.2.1 RNA的提取和实时定量RT-PCR检测 使用Trizol（Invitrogen）提取腺样囊性癌和正常腺体安排中的总RNA，实时定量RT-PCR（qRT-PCR）依照TaKaRa的SYBR green试剂盒阐明说进行操作。Runx3及GAPDH引物由上海生工公司规划并出产。Runx3的上游引物为：5-CACTGGCGCTGCAACAAGA-3，Runx3的下流引物为：5-CACGAAGCGAAGGTCGTTGA-3。GAPDH的上游引物为：5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH的下流引物为：5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3。
1.2.2 免疫安排化学检测 选用超敏S-P法染色，一抗为兔抗人Runx3多克隆抗体（Abcam，美国），抗兔二抗试剂盒购自福州迈新公司，按试剂盒阐明书进行免疫安排化学操作，白腊安排切片经过脱蜡、水化，3%过氧化氢室温孵育10 min，0.01 M枸橼酸盐缓冲液高压锅抗原修正，正常山羊血清关闭30 min，滴加1∶100抗人Runx3一抗，湿盒中4℃过夜，滴加生物素化二抗室温30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水、通明、封片，以细胞核或细胞浆内的棕黄色颗粒为阳性染色成果。以Image-Pro Plus（version 5.1，美国）剖析高倍镜下（400×）阳性细胞数，阳性细胞数<10%为低表达组，≥10%为Runx3高表达组。
1.3 统计学办法
选用SPSS17.0统计学剖析软件，Runx3的表达水平与肿瘤的临床病理要素相关性选用χ2查验，以单要素方差剖析Runx3 mRNA表达水平在肿瘤和配对的正常安排中的差异，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 Runx3 mRNA在腺样囊性癌和正常涎腺安排中的表达
RT-PCR检测不同安排中Runx3 mRNA表达成果发现：腺样囊性癌（T）中Runx3 mRNA的表达水平明显低于配对的正常腺体安排（N），差异具有统计学含义（P<0.05）。见图1。
2.2 免疫组化检测Runx3蛋白在腺样囊性癌安排中亚细胞定位表达成果
免疫安排化学检测Runx3蛋白的表达成果标明：在正常涎腺中，Runx3表达首要表达在导管上皮和腺泡细胞核中，而在SACC中，Runx3蛋白的表达水平明显下降（图2），其表达首要定位在肿瘤细胞细胞浆中，在细胞核中也存在表达。
2.3 Runx3表达水平与腺样囊性癌的临床病理要素的相关性
免疫安排化学检测成果显现：58例SACC安排中，Runx3高表达15例，Runx3低表达43例。58例腺样囊性癌患者的临床病理要素剖析标明，Runx3低表达与实性型病理分型（P=0.025）、T分期（P=0.005）及淋巴结搬运（P=0.040）明显相关，与远处搬运存在弱相关（P=0.054）明显相关，而与发病年纪及性别无统计学含义（P>0.05）。见表1。
3 评论
唾液腺腺样囊性癌存在部分侵袭性强和高搬运等生物学特色，为口腔颌面部肿瘤远处搬运率最高的恶性肿瘤之一，其滋润、搬运机制是很多学者的重视焦点。作为TGF-β/SMAD诱导细胞凋亡通路中的一个重要下流调控因子，Runx3表达的下调甚或表达缺失与肿瘤的远处搬运存在必定联络。而另一方面，当肿瘤中康复RUNX3的表达能明显的按捺肿瘤细胞的搬迁及侵袭才能[9]。Sakakura等[3]报导在存在腹膜搬运的胃癌中Runx3的表达缄默沉静影响一些与搬运相关，比方细胞黏附、增殖、凋亡相关的因子等重要的基因的表达，而且促进了胃癌的腹膜搬运。Peng等[5]经过动物试验验证了在结肠癌细胞中康复Runx3蛋白的表达能按捺结肠癌细胞的远处搬运。本研讨也发现Runx3低表达的腺样囊性癌具有更强的侵袭性，而且具有更高的侵袭才能和远处搬运的危险，提示Runx3的表达下调是腺样囊性癌高侵袭和远处搬运的一个危险要素，这与其他一些学者的研讨共同[10，11]。
在与临床病理要素的相关性比较中发现，Runx3的表达水平与肿瘤实体型病理类型明显相关（P=0.025）。因为腺样囊性癌实体型亚型具有更强的侵袭性[12]，而且Runx3作为一个抑癌基因，在癌细胞的增值和分解中具有重要的调控效果[13-14]，因而咱们估测，Runx3蛋白在实体型腺样囊性癌中的低表达在必定程度上阐明Runx3与实体型腺样囊性癌的高侵袭性存在密切联络。别的，研讨指出Runx3表达率低于10%关于肺腺癌患者是一个很强的预后方针[15]。一起，Runx3低表达或缄默沉静能明显地影响喉鳞癌患者的生存率[16]，能够作为喉癌的预后剖析因子[17]。有研讨标明Runx3蛋白的表达下降与食管鳞癌对放疗敏感性下降明显相关，并导致患者预后水平明显下降[16]。由此，Runx3的表达能够作为腺样囊性癌患者的预后因子，而且有或许作为一个基因靶向医治的方针基因[18，19]。
综上所述，咱们发现在人正常唾液腺安排和腺样囊性癌中都存在不同程度的Runx3蛋白表达。Runx3蛋白表达下调甚或表达按捺或许是唾液腺囊性癌发作的一个重要机制。Runx3的表达与肿瘤的病理类型、淋巴结搬运和远处搬运明显相关，或许是临床确诊和医治SACC的重要生物标志物。但是Lotem等[20]学者以为Runx3并非作为一个抑癌基因在调控肿瘤的发作，而是在免疫及炎症中发挥效果，然后间接调控肿瘤的发作。因而唾液腺腺样囊性癌中Runx3蛋白表达下调的调控机制及相关功用还有待深入研讨，涎腺的肿瘤发作和炎症直接或许存在相关性。
[参阅文献]
[1] Nakamura S，Senzaki，Yoshikawa M，et al. Dynamic regulation of the expression of neurotrophin receptor by Runx3[J].Development，2008，135（9）：1703-1711.
[2] Wei D，Gong W，Oh SC，et al. Loss of RUNX3 expression significantly affects the clinical outcome of gastric cancer patients and its restoration causes drastic suppression of tumor growth and metastasis[J]. Cancer Res，2005，65（11）：4809-4816.
[3] Sakakura C，Hasegawa K，Miyagawa K，et al. Possible involvement of RUNX3 silencing in the peritoneal metastases of gastric cancers[J]. Clin Cancer Res，2005，11（18）：6479-6488.
[4] Peng Z，Wei D，Wang L，et al. RUNX3 inhibits the expression of vascular endothelial growth factor and reduces the angiogenesis，growth，and metastasis of human gastric cancer[J]. Clin Cancer Res，2006，12（21）：6386-6394.
[5] Peng Z，Tang H，Wang X，et al. Inhibition of the growth and metastasis of human colon cancer by restoration of RUNX3 expression in cancer cells[J]. Int J Oncol，2008，33（5）：979-984.
[6] Whittle MC，Izeradjene K，Rani PG，et al. RUNX3 controls a metastatic switch in pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Cell，2015，161（6）：1345-1360.
[7] Lee YS，Lee JW，Jang JW，et al. Runx3 inactivation is a crucial early event in the development of lung adenocarcinoma[J]. Cancer Cell，2013，24（5）：603-616.
[8] Cheng HC，Liu YP，Shan YS，et al. Loss of RUNX3 increases osteopontin expression and promotes cell migration in gastric cancer[J]. Carcinogenesis，2013，34（11）：2452-2459.
[9] Chen H，Wang Z，Zhang Z，et al. Effect and mechanism of RUNX3 gene on biological characteristics of human esophageal squamous cell carcinoma （ESCC）[J]. Med Oncol，2015，32（1）：357.
[10] Xue LN，Bai FH，Wang XY，et al. Expression of RUNX3 gene in pancreatic adenocarcinoma and its clinical significance[J]. Genet Mol Res，2014，13（2）：3940-3946.
[11] Chen HX，Wang S，Wang Z，et al. Overexpression of RUNX3 inhibits malignant behaviour of Eca109 cells in vitro and vivo[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（4）：1531-1537.
[12] Szanto PA，Luna MA，Tortoledo ME，et al. Histologic grading of adenoid cystic carcinoma of the salivary glands[J]. Cancer，1984，54（6）：1062-1069.
[13] Ito Y，Miyazono K. RUNX transcription factors as key targets of TGF-beta superfamily signaling[J]. Curr Opin Genet Dev，2003，13：43-47.
[14] Li QL，Ito K，Sakakura C，et al. Causal relationship between the loss of RUNX3 expression and gastric cancer[J].Cell，2002，109（1）：113-124.
[15] Araki K，Osaki M，Nagahama Y，et al. Expression of RUNX3 protein in human lung adenocarcinoma：Implications for tumor progression and prognosis[J]. Cancer Sci，2005，96（4）：227-231.
[16] Sakakura C，Miyagawa K，Fukuda KI，et al. Frequent silencing of RUNX3 in esophageal squamous cell carcinomas is associated with radioresistance and poor prognosis[J].Oncogene，2007，26（40）：5927-5938.
[17] Shi M，Wang Z，Liu XY，et al. Inactivation of RUNX3 predicts poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma after Ivor-Lewis esophagectomy[J]. Med Oncol，2014，31（12）：309.
[18] Yang JS，Lee C，Cho M，et al. Discovery of orally available runt-related transcription factor 3（RUNX3） modulators for anticancer chemotherapy by epigenetic activation and protein stabilization[J]. J Med Chem，2015，58（8）：3512-3521.
[19] Yu YY，Chen C，Kong FF，et al. Clinicopathological significance and potential drug target of RUNX3 in breast cancer[J]. Drug Des Devel Ther，2014，8：2423-2430.
[20] Lotem J，Levanon D，Negreanu V，et al. Runx3 at the interface of immunity，inflammation and cancer[J]. Biochim Biophys Acta，2015，1855（2）：131-143.
（收稿日期：2015-05-22）