黄芩苷 黄芩苷对胃癌BGC—823、MGC—803细胞搬迁才能的影响

王雄伟 徐燕 李海龙 陈凤琴 吴红彦

摘要：意图 调查黄芩苷对胃癌BGC-823、MGC-803细胞搬迁的影响，评论其或许的效果机制。办法 划痕试验和Transwell小室调查Toll样受体（TLR）激活后以及黄芩苷干涉TLR激活后胃癌BGC-823、MGC-803细胞搬迁才能；RT-qPCR和Western blot检测胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、激活蛋白-1（AP-1）、血管内皮成长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。效果 脂多糖（LPS）可促进胃癌BGC-823、MGC-803细胞搬迁，黄芩苷可按捺LPS干涉后胃癌BGC-823、MGC-803细胞搬迁；LPS可上调TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达，黄芩苷可下调LPS干涉后胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达。定论 黄芩苷可阻断TLR4-AP-1-VEGF的激活，然后按捺胃癌BGC-823、MGC-803细胞的搬迁。

关键词：脂多糖；Toll样受体；黄芩苷；搬迁；胃癌

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0064-05

炎症与肿瘤联系密切，缓慢炎症与25%以上癌症的发作相关，参加肿瘤的发作、开展，促进肿瘤的侵袭与搬运[1]。胃癌的发作与缓慢炎症密切相关，“Hp感染-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生-胃癌”是典型的炎症与癌症相关的比如。寻觅一种既抗炎又抗肿瘤的药物是抗肿瘤研讨的重要方向。黄芩苷是唇形科

植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的枯燥根中提取的一种黄酮类化合物。研讨标明，黄芩苷有抗肿瘤[2]、抑菌抗炎[3]等药理效果。脂多糖（LPS）是Toll样受体（TLR）的外源性配体，能激活TLR的核因子（NF）-κB及激活蛋白-1（AP-1）等信号通路，引起多种细胞的炎症反响[4]。本试验选用LPS干涉胃癌BGC-823、MGC-803细胞激活TLR，调查LPS对胃癌细胞搬运才能的影响，并用黄芩苷加以干涉，调查黄芩苷对胃癌细胞侵袭搬运才能的影响，开始评论其或许的效果机制，为黄芩苷医治炎症相关性肿瘤供给试验依据。

1 试验资料

1.1 细胞株

胃癌MGC-803、BGC-823细胞，我国科学院上海生命科学研讨院。

1.2 药物与试剂

黄芩苷，南京狄尔格医疗器械有限公司，CAS号21967-41-9。高糖DMED培育基，健顺生物公司；胎牛血清（FBS），杭州四季青公司；Maker和Transwell小室，Thermo scientific公司；回转录试剂盒、PCR扩增试剂盒，大连宝生物公司，引物均由大连宝生物公司组成；一抗TLR4、AP-1、血管内皮成长因子（VEGF）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）购自Affinity公司，二抗购自碧云天公司。

1.3 首要仪器

光学显微镜（日本Nikon公司），超净工作台（苏静安泰），CO2培育箱（Thermo公司），微量移液枪（日本立洋），TGL-16G离心机（上海医疗器械七厂），低温离心机（Beckman公司），电泳仪（北京六一仪器厂），微量上样器（上海生工生物工程有限公司）。

2 试验办法

2.1 细胞培育

用含10%FBS高糖DMEM，加青霉素、链霉素（100 U/mL），37 ℃、5%CO2细胞培育箱中惯例培育胃癌MGC-803、BGC-823细胞。每隔2 d换彻底培育基，待细胞密度达90%时按1∶2份额传代。取对数成长期细胞用于下一步试验。

2.2 划痕试验

将对数成长期细胞接种于预先底部画线的6孔板，待细胞贴壁成长至满，用10 μL无菌枪头垂直于底部划线性划痕，PBS漂洗3次去除掉落细胞，再用无血清培育液[分为对照组（只加培育液）、LPS组（1、10、100、1000、10 000 ng/mL）、黄芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL组]干涉，持续培育。划痕后0、12、24、36 h随机挑选划痕区3个视界摄影，比较各组间划痕愈合的差异，用愈合率代表细胞搬迁才能。核算细胞愈合率[（愈合前细胞间空白区域面积-愈合后细胞间空白区域面积）÷愈合前细胞间空白区域面积×100%]。

2.3 Transwell小室试验

将对数成长期细胞饥饿12 h后，按5×105个/mL细胞的密度接种于24孔培育板内的Transwell小室中，置于培育箱中持续培育至细胞贴壁后，吸出小室中培育液，换新的无血清培育基[分为对照组（只加培育液）、LPS组（1000 ng/mL）、黄芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL组]持续培育，鄙人室中加600 μL含25%FBS的DMEM细胞培育液，培育箱中培育24 h，经PBS洗刷，甲醛固定，甲醇浸透，结晶紫染色后镜下选3个视界摄影计数，取其平均值，以穿过小室细胞数代表细胞的搬迁才能。

2.4 RT-qPCR检测

将对数成长期胃癌MGC-803、BGC-823细胞分为对照组（只加培育液）、LPS组（1000 ng/mL）、黄芩苷40 μmol/L+LPS 1000 ng/mL组，干涉24 h，提取各组总RNA，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃回转录成cDNA；95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，65 ℃、30 s，经过40个循环，cDNA扩增，检测TLR4、AP-1、VEGF mRNA表达。PCR反响完毕后剖析融解曲线，然后断定扩增产品是否有非特异性扩增；剖析扩增曲线，核算Ct值，选用2?ΔΔCt法核算mRNA的相对表达量。

2.5 Western blot检测

将对数成长期胃癌MGC-803、BGC-823细胞分为对照组（只加培育液）、LPS组（1000 ng/mL）、黄芩苷（40 μmol/L）+LPS（1000 ng/mL）组干涉24 h，参加蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取总蛋白，将蛋白煮沸变性后，经12%SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白别离，湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉关闭1.5 h，一抗（TLR4、AP-1、VEGF、GAPDH）孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，参加ECL于Bio-rad凝胶成像仪中进行反响，选用Image J软件对Western blot效果进行定量剖析，灰度值以累积吸光度值标明，效果以意图蛋白与GAPDH累积吸光度的比值标明。

3 计算学办法

选用SPSS17.0计算软件进行剖析。试验数据以—x±s标明，组间比较选用方差剖析。P<0.05标明差异有计算含义。

4 效果

4.1 划痕试验黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞搬迁才能的影响

与对照组比较，LPS组划痕愈合程度显着高于对照组，并随浓度的增大，愈合程度也逐步增强，其间，1000 ng/mL LPS组愈合程度最强，24 h时效果最显着，见图1、图2。依据以上效果，选用1000 ng/mL LPS作为LPS组。依据前期试验MTT效果，选用40 μmol/L黄芩苷干涉作为黄芩组。持续用划痕试验调查黄芩苷对LPS干涉后2株胃癌细胞搬迁才能的影响，效果发现LPS+黄芩苷组较LPS组愈合程度慢，差异有计算含义（P<0.01），见图3、图4。

4.2 Transwell试验黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞搬迁才能的影响

选用1000 ng/mL LPS作为LPS组，选用40 μmol/L黄芩苷干涉作为黄芩苷组，持续用Transwell试验调查黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞搬迁才能的影响。与对照组比较，LPS组2株细胞穿过小室细胞数较多（P<0.01）；与LPS组比较，LPS+黄芩苷组穿过小室细胞数较少（P<0.01），见图5、图6。

4.3 黄芩苷对Toll样受体4、激活蛋白-1、血管内皮成长因子基因表达的影响

与对照组比较，LPS组TLR4、AP-1、VEGF mRNA表达显着升高（P<0.01）；与LPS组比较，LPS+黄芩苷组TLR4、AP-1、VEGF mRNA表达显着下降（P<0.01）。效果见图7、图8。

4.4 黄芩苷对Toll样受体4、激活蛋白-1、血管内皮成长因子蛋白表达的影响

与对照组比较，LPS组TLR4、AP-1、VEGF蛋白表达显着升高（P<0.01）；与LPS组比较，LPS+黄芩苷组TLR4、AP-1、VEGF蛋白表达显着下降（P<0.01）。效果见图9、图10。

5 评论

近年来很多的试验标明，炎症不只与肿瘤的发作密切相关，与肿瘤搬运也密切相关，在这个范畴现在已获得一些开始效果，如versican-TLR2-TNFα、RANKL-RANK-IKKFα-Maspin通路等[5]。

现在中药成分抗肿瘤的研讨已成为热门。杜氏等[6]报导雷公藤红素按捺HepG2细胞的搬迁，朱氏等[7]研讨痰瘀同治方药物血清有影响人脐静脉内皮细胞增殖和搬迁的效果。咱们的前期试验也发现，黄芩苷可经过逝世受体通路诱导胃癌细胞凋亡。一起有研讨发现黄芩苷可按捺结肠癌细胞的搬迁[8]。

LPS是革兰阴性菌细胞壁的首要成分，在缓慢炎性反响过程中发挥重要效果。本试验意图在于用LPS营建一个肿瘤的炎性微环境，调查LPS是否促进胃癌MGC-803、BGC-823细胞搬迁以及黄芩苷是否按捺炎性微环境胃癌细胞的搬迁。本研讨经过划痕试验及Transwell小室试验证明了LPS可促进以上2株胃癌细胞的搬迁，且发现黄芩苷可按捺LPS干涉的胃癌MGC-803、BGC-823细胞搬迁。研讨发现，LPS与TLR4结合后可诱导肺癌细胞发作转化成长因子、VEGF及白细胞介素-8，一起LPS可使肺癌细胞的VEGF表达升高，促进肺癌细胞的搬运[9]。本研讨效果也证明了这一点。

Qian等[10]研讨显现，LPS可激活膀胱癌细胞的TLR4 信号转导通路，激活MAPK。Ouyang等[11]进一步研讨标明，MAPK可激活AP-1，AP-1以由c-Jun、c-Fos和亮氨酸拉链结构域构成的异源二聚体的方式存在于细胞中，在肿瘤的发作和演进过程中起关键性的调节效果，且VEGF基因启动子中含有多个AP-1结合位点，活化的AP-1能够经过VEGF促进肿瘤细胞侵袭与搬运。因而，能够以为LPS激活肿瘤细胞的TLR4信号转导通路，激活MAPK，然后激活AP-1，终究激活VEGF，导致肿瘤细胞的搬运。

Feng等[12]研讨显现，黄芩苷可下调TLR4表达。本研讨发现，LPS干涉的2株胃癌细胞TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达均显着升高，而黄芩苷可下调LPS干涉后的TLR4、AP-1、VEGF mRNA和蛋白表达。由此能够以为，黄芩苷或许经过按捺LPS与TLR4的结合，然后按捺MAPK激活AP-1，按捺VEGF表达，进而按捺2株胃癌细胞的搬迁。

本试验只调查LPS及黄芩苷对胃癌MGC-803、BGC-823细胞搬迁的影响及或许的效果机制，其对2株胃癌细胞侵袭的影响尚未可知，需进行更多的试验调查验证。

参考文献：

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