低氧血症sp02确诊规范 补肾清肝中药配伍对间歇性低氧诱导人脐静脉内皮细胞损害模型p38MAPK/NF—κB信号通路的干涉效应研讨

邬春晓+张京春+刘玥+马林沁+乔羽+雷舒雁+郑乔仙

[摘要] 研讨补肾清肝中药配伍对间歇性低氧致人脐静脉内皮细胞危害模型p38MAPK/NF-κB信号通路的干涉效应。试验选用改进的间歇性低氧诱导人脐静脉内皮细胞树立体外细胞危害模型，以补肾清肝中药有用成分配伍（异钩藤碱、桃叶珊瑚苷及川芎嗪）作为干涉药物，首要进行中药最优配伍浓度体外挑选，然后挑选最优配伍浓度作为干涉剂量，调查其对模型p38MAPK/NF-κB信号通路的干涉效应。成果显现异钩藤碱、桃叶珊瑚苷及川芎嗪在0.01 mg·L-1时具有最佳的体外抗炎效应。间歇性低氧组NF-κB p65入核量及p-IκB较对照组与其他各组均显着添加，一起免疫荧光染色NF-κB p65可见间歇性低氧组呈现显着NF-κB p65核移位体现，内皮细胞黏附程度显着添加；与间歇性低氧组比较，p38MAPK按捺剂组及补肾清肝中药配伍组 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量及p-IκB表达量均显着较少，内皮细胞黏附显着被按捺。该研讨标明，补肾清肝中药最优浓度配伍经过将按捺p38MAPK的磷酸化作为开始，继而阻断了NF-κB的核移位行为，按捺其转录功用，完成对间歇性低氧诱导血管内皮细胞危害模型的维护效应。

[关键词] 间歇性低氧； 人脐静脉内皮细胞； 中药； p38MAPK； NF-κB

[Abstract] This study aims to explore the intervention effect of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver on intermittent hypoxia（IH） induced injury model of HUVECs through p38MAPK/NF-κB signaling pathway in vitro. HUVECs injury model was induced by modified IH treatment. The effective components of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver including isochteroside， aucubin and ligustrazine were used as intervention drugs. The optimal compatibility concentration of them was screened in vitro， and then the optimal compatibility concentration was selected as the intervention dose to observe the effect on p38MAPK/NF-κB signaling pathway in IH induced injury model of HUVECs. The results showed that isochnae， aucubin and ligustrazine had the best anti-inflammatory effect at concentration of 0.01 mg·L-1. NF-κB p65 and p-IκB in the nucleus in IH group were significantly higher than those in the normal control（N） group and the other groups. Immunofluorescence staining showed significant translocation of NF-κB p65 nucleus in IH group， and HUVECs adhesion capacity in IH group was increased significantly. As compared with IH group， the expression levels of p-p38MAPK， NF-κB p65 and p-IκB in p38MAPK inhibitor（INH） group and Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver（GDC） group were significantly decreased， and HUVECs adhesion capacity in INH group and GDC group was significantly inhibited as well. The optimal concentration of Chinese medicine of nourishing kidney and clearing liver can inhibit the phosphorylation of p38MAPK， and then inhibit the nuclear translocation and transcription function of NF-κB. This may be the mechanism of the protective effect of Chinese medicine on IH induced injury model of HUVECs.

[Key words] intermittent hypoxia； HUVECs； Chinese medicine； p38MAPK； NF-κB

《我国心血管病陈述2016》指出，高血壓是心脑血管疾病的重要风险要素之一，50%～75%的脑卒中和40%～50%的心肌梗死发作均与血压升高相关。堵塞型睡觉呼吸暂停综合征（OSAS）是独立于年纪、肥壮、吸烟等引起高血压的重要风险要素。OSAS患者睡觉中频频发作的呼吸暂停，使机体处于间歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）和再氧合替换呈现的特别内环境。IH不同于继续低氧的特点是存在低氧后的正常氧的刺进，较继续低氧使更易于构成血管内皮功用的危害，是OSAS致高血压靶器官危害的重要机制之一[1]。中医药对高血压在调理机体全体平衡、操控血压水平安稳及防治靶器官危害等方面具有共同优势。作者在前期临床试验中，深化探究高血压病的中医病机与证治规则，发现补肾清肝中药配伍医治轻中度高血压具有维护血管内皮功用、调控血压变异性等靶器官维护效应[2]，但详细效果机制尚不清晰。本研讨经过间歇性低氧诱导人脐静脉内皮危害树立体外模型，调查补肾清肝中药配伍对该模型p38MAPK/NF-κB信号通路的干涉效应，以期为中药对OSAS相关心血管疾病的防治供给试验依据。endprint

1 资料与办法

1.1 药物 中药钩藤的有用成分异钩藤碱（批号111927-201403）、中药杜仲的有用成分桃叶珊瑚苷（批号111761-200601）、中药川芎的有用成分川芎嗪（批号110817-201307）均由我国食品药品检定研讨院供给。

1.2 细胞来历 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）由健康产妇、正常临产12 h内脐带的脐静脉别离提取（脐带由中日友爱医院妇产科供给）。

1.3 HUVECs的别离及培育 无菌条件下取健康产妇、正常临产12 h内脐带20～30 cm，PBS冲刷脐带并去除两头，镊子扩张静脉腔，刺进三通管并固定。三通管另一端衔接针头后刺进倒置的PBS瓶中，抽推动器使PBS流入针筒，封闭此开关阀后推推动器使PBS流入脐带，留意避免气泡。以上操作清洗脐带2～3次直至无肉眼可见血色。脐带结尾刺进带有胶皮管的针头，重复清洗1次后，将衔接三通管针头刺进0.1%胶原酶溶液瓶中，倒置酶瓶后抽推动器使酶液流入针管，封闭此开关阀后推推动器直至酶液充溢整条脐带。脐带置入37 ℃水浴15 min后收回消化液，PBS清洗后重复收回2次，搜集消化液，参加预先室温放置的ECM（20%FBS）5 mL，灌洗、离心（1 000 r·min-1，5 min）搜集细胞，制成细胞悬液按1×106～1.5×106个/mL接种于10 mL培育皿中，置于37 ℃，5%CO2条件下培育。细胞90%以上单层交融状况时用0.25%胰蛋白酶消化、传代培育至4～7代用于以下试验。

1.4 间歇性低氧致HUVECs危害模型的仿制 模型仿制办法参考文献进行改进[3]。运用低氧设备Modular Incubator Chamber（MIC-101）（美国 Billups-rothenberg）树立间歇性低氧诱导内皮危害细胞模型。将细胞培育皿放入低氧设备中（预先紫外照耀消毒），露出时以低氧（1%O2，4%CO2，96%N2）气流洗脱细胞培育舱中的气体，监测直至氧气浓度到达5%后中止。继而保持低氧状况5 min（即IH时段），再以正常氧（21%O2）气流洗脱低氧气体，然后再保持10 min（即再氧合时段），循环往复构成循环2，4，6，8次逐级递增至16次。

1.5 分组与干涉办法 正常对照组（N）：将培育基换为无血清ECM，培育箱中惯例培育4 h。间歇性低氧模型组（IH）：将培育基换为无血清ECM，置于低氧设备内，低氧/复氧循环16次（4 h）。补肾清肝中药配伍组（GDC 1，0.1，0.01，0.001）：将异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪均按1，0.1，0.01，0.001 mg·L-1参加到无血清ECM中，替换原培育基，低氧/复氧循环16次（4 h）。p38MAPK按捺剂组（INH）： 将培育基换为无血清ECM，p38MAPK阻断剂SB203580 5 mg·L-1预处理30 min，尔后置于低氧设备内，低氧/复氧循环16次（4 h）。

1.6 检测目标及办法 炎症因子检测：实时荧光定量PCR（QPCR）技能测定HUVECs上清液中IL-1，IL-6，ICAM-1，E-selectin及TNF-α的含量。p38MAPK/NF-κB通路相关蛋白的检测：选用Western blot的办法检测各组间p-p38MAPK表达量的改变。别离细胞胞浆、胞核蛋白后检测NF-κB通路炎症相关蛋白胞浆、胞核中表达量差异。HUVECs细胞间黏附才能检测：荧光探针符号THP-1细胞，参加处理后HUVEC 细胞37 ℃共孵育30 min，荧光显微镜下摄影比较黏附密度。

1.7 计算办法 数据选用SPSS 20.0计算软件剖析处理，试验数据均选用±s标明，组间比较选用t查验，2组以上比较选用One-way ANOVA，查验显着性水平定为P<0.05。

2 成果

2.1 补肾清肝中药配伍最佳干涉剂量的挑选 为评论补肾清肝中药配伍的体外对炎症因子的干涉效应，一起进行其最佳干涉剂量的挑选，别离设立了异钩藤碱、桃叶珊瑚苷及川芎嗪1，0.1，0.01，0.001 mg·L-14个质量浓度梯度进行挑选。成果显现补肾清肝中药配伍在0.01 mg·L-1（GDC）这个剂量浓度时炎症因子的表达IL-1，IL-6，TNF-α显着低于其他各干涉组（P<0.05），见图1。因而选定0.01 mg·L-1作为最佳干涉剂量进行后续试验。

2.2 补肾清肝中药配伍最佳干涉剂量对p38MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 Western blot成果显现，IH组中NF-κB p65入核量、p-IκB较对照组与其他组均显着添加，NF-κB通路显着被激活。IκB，p-p65，IKK-β等无显着改变，见图2。一起免疫荧光染色NF-κB p65，Confocal镜下可见IH组呈现显着NF-κB p65核移位体现。蓝色符号的HUVECs细胞核內呈现绿色荧光符号的NF-κB p65。入核后的NF-κB p65亮度显着高于胞浆中表达的NF-κB p65，见图2。INH组、GDC组 p-p38MAPK，NF-κB p65入核量、p-IκB表达量与IH比较显着较少，阐明补肾清肝中药配伍及p38MAPK阻断剂SB203580可经过按捺IH后p38MAPK的磷酸化阻断其下流NF-κB信号通路。

2.3 补肾清肝中药配伍最佳干涉剂量对间歇性低氧诱导HUVECs危害过程中 THP-1 细胞黏附的影响 荧光显微镜下调查，正常对照（N）组（128.2±6.72）可见少数 THP-1细胞黏附；IH组（231.2± 8.43）可见显着添加THP-1 细胞黏附；GDC组（134.8±8.67）可见显着按捺THP-1细胞黏附于HUVEC；INH组（122.4±7.12）可见显着按捺THP-1细胞黏附于HUVEC，见图3。

3 评论endprint

在树立安稳的间歇性低氧诱导人脐静脉内皮细胞危害模型基础上，调查了不同浓度的补肾清肝中药配伍的干涉效应，发现异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪在0.01 mg·L-1这个剂量时具有最佳的按捺炎症因子的效应，并不具有剂量依赖性。

很多研讨报导补肾清肝中药配伍的各有用组分（异钩藤碱、桃叶珊瑚苷、川芎嗪）具有广泛的心血管体系药理效果。桃叶珊瑚苷是中药杜仲的首要活性成分，具有显着的抗炎活性，可以按捺NF-κB的p65亚基由细胞胞浆内向核内的移位，并经过阻挠IκB的磷酸化和降解，使胞浆内IκB浓度升高，进而按捺NF-κB活性然后下调TNF-α和IL-6的组成与表达[4]。关于桃叶珊瑚苷及桃叶珊瑚苷苷元抗炎活性的进一步研讨标明，真实发挥效果的分子可能是桃叶珊瑚苷水解产品桃叶珊瑚苷苷元，桃叶珊瑚苷苷元经过按捺细胞中NF-κB活性进一步按捺TNF-α的生成[5-6]，与本研讨成果共同。异钩藤碱是茜草科植物钩藤的首要有用成分，具有降压及抗炎效果。有学者研讨发现静脉注射异钩藤碱可下降未开胸犬的均匀动脉压；一起可以调控NO的发生，下降磷酸化细胞外信号调理激酶蛋白和p38MAPK，按捺炎症反响，起到维护血管、下降血压的效果[7-8]。研讨标明川芎嗪可经过改进氧化應激，下降炎性因子水平，拮抗Ca离子内流，调控一氧化氮水平，按捺血管内皮炎症性危害等完成降压效果[9-11]。为进一步评论补肾清肝中药配伍血管内皮维护机制，从体外视点调查了中药干涉后模型NF-κB通路蛋白表达量的改变，成果发现，与模型组比较，补肾清肝中药配伍最优剂量组p-p38MAPK，p-IκB的表达显着被按捺；一起选用免疫荧光符号NF-κB p65，调查到补肾清肝中药配伍干涉后的NF-κB p65入核量显着削减。

综上所述，补肾清肝中药配伍将按捺p38MAPK的磷酸化作为开始，阻断NF-κB的核移位，按捺其转录功用，终究完成其对间歇性低氧诱导血管内皮细胞危害模型的维护效应。

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[责任编辑 张宁宁]endprint