知母皂苷 知母皂苷AⅢ按捺人脑胶质瘤增殖成长的机制研讨

谭希+潘会君+吴伟达+章丹丹

[摘要]调查知母皂苷AⅢ按捺人脑胶质瘤U87MG细胞增殖的效果及机制剖析。在裸鼠皮下荷瘤模型中，知母皂苷AⅢ组与模型组比较，明显下降瘤重。知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性按捺U87MG细胞的体外增殖；呈剂量依赖性下降βCatenin，Cyclin D1，Bcl2的蛋白表达，一起升高p21在蛋白和基因水平的表达；下降ERK磷酸化水平，按捺βCatenin的核搬运，一起进步p38和JNK蛋白的磷酸化水平。联用JNK按捺剂SP600125和p38按捺剂SB203580后可反转知母皂苷AⅢ处理而进步的p21和下降的βCatenin的蛋白表达。知母皂苷AⅢ部分经过干涉MAPK及Wnt/βCatenin信号通路而按捺脑胶质瘤U87MG的增殖。

[要害词]知母皂苷AⅢ；人脑胶质瘤U87MG；细胞增殖；MAPK信号通路；Wnt/βCatenin信号通路

[Abstract]To explore the inhibitory effect of timosaponin AⅢ on the proliferation of human glioblastoma cell line U87MG and investigate its related mechanism As compared with the model group， the tumor weight was significantly reduced in timosaponin AⅢtreated group Timosaponin AⅢinhibited the proliferation of U87MG cell line in a dosedependent manner It upregulated the gene and protein expression levels of p21， meanwhile inhibited the protein expression levels of βCatenin， Cyclin D1 and Bcl2 It also inhibited the translocation of βCatenin into nucleus， suppressed the phosphorylation expression of ERK， but increased the phosphorylation expression of p38 and JNK Combined use of JNK inhibitor SP600125 and p38 inhibitor SB203580 could decrease p21 and increase βCatenin protein expressions Timosaponin AⅢ inhibited the proliferation of human glioblastoma cell line U87MG partly by intervening MAPK and Wnt/βCatenin signal pathways

[Key words]timosaponin AⅢ； human glioblastoma cell U87MG； cell proliferation； MAPK signal pathway； Wnt/βCatenin signal pathway

中藥知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge的枯燥根茎，具有滋阴润燥、清热泻火等成效。其性寒，味苦，归肺、胃、肾经，临床用于外感热病、骨蒸潮热、肺热燥咳、高热烦渴等症状[1]。其首要药理活性成分知母皂苷在知母根茎中的质量分数约为6% [2]。国表里研讨人员发现知母皂苷AⅢ能按捺ADP诱导的血小板集合、诱导肿瘤细胞自噬等[34]，近年来关于知母皂苷AⅢ抗肿瘤活性的研讨日益深化[57]，有期望将其开发成一种新的抗癌类药物。

脑胶质瘤（脑胶质细胞瘤）约占颅内肿瘤的70%。恶性脑胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第二位逝世原因，患者均匀存活的中位时刻是14个月。脑胶质瘤多呈侵袭性成长，整体效果欠安，是神经外科医治中最扎手的难治性肿瘤之一[810]。现在没有有知母皂苷AⅢ按捺脑胶质瘤增殖成长的相关报导。该文调查知母皂苷AⅢ体表里按捺脑胶质瘤增殖成长的效果并依据MAPK信号通路和Wnt/βCatenin信号通路调查其机制。

1材料

11药物与试剂知母皂苷AⅢ、淫羊藿苷Ⅱ、红景天苷、原薯蓣皂苷元均购自上海同田生物技术股份有限公司；人脑恶性胶质瘤细胞株U87MG购自美国ATCC公司；DMEM干粉培育基、胎牛血清购自Gibco公司；二甲基亚砜、噻唑蓝购自西格玛奥德里奇（SigmaAldrich）公司；cDNA反转录试剂盒、Trizol试剂购自赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）公司；RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒、蛋白酶按捺剂和磷酸酶按捺剂PhosSTOP均购自美国Roche公司；引物均由生工生物工程（上海）有限公司组成。Marker预染蛋白购自Progema公司；NC膜购自英国沃特曼Whatman公司；一抗βactin，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK，βCatenin购自美国细胞生物技术（Cell Signaling Technology）公司；p21、Cyclin D1抗体、二抗山羊抗鼠、二抗山羊抗兔均购自美国abCAM公司。ECL化学发光试剂盒购自美国通用公司生命技术科学部分（GE）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA蛋白强裂解液、Bcl2抗体、HDAC1抗体、细胞核蛋白细胞浆蛋白抽提试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为剖析纯。

12仪器生物安全柜（Delta series，Labconco，美国）；CO2培育箱（HEPA CLASS100，Thermo，美国）；细胞计数仪（XDS500C，上海蔡康光学仪器有限公司）；倒置显微镜（IX 71，Olympus，日本）；QB9006 恒温微孔板快速振荡器（海门市其林贝尔仪器有限公司）；荧光定量PCR仪（7500 Fast System，Applied Biosystems公司，美国）；超声波细胞粉碎机（JY922D，宁波新芝生物股份有限公司）；低温高速离心机（Eppendorf Centrifuge 5810R，德国）；电泳仪（PowerPacTMHC，BIORAD公司，美国）；脱色摇床（TS8，Kylinbell Lab Instruments，我国）；凝胶成像系统（Tanon NIM2045，上海天能公司）；Spectra MAX190酶标仪（MD公司，美国）。

2办法

21细胞培育U87MG细胞培育于添加了10%胎牛血清的DMEM培育基中，置于37 ℃恒温、5%CO2培育箱中饱和湿度的条件下培育。安稳传2～3代后，挑选处于对数成长期细胞用于后续试验。

22树立裸鼠皮下移植瘤模型在裸鼠左上肢腋下缓慢推注打针02 mL U87MG细胞混悬液，含2×106个细胞。定时观测裸鼠成瘤的时刻和瘤体积巨细。肿瘤的体积用游标卡尺丈量肿瘤的最长径（a）及最短径（b），并依据公式V= ab2/2进行核算。成瘤后，给予中药单体1 mg·kg-1腹腔打针14 d，取瘤称重，免疫组化检测Ki67。

23MTT法调查知母皂苷AⅢ对U87MG脑胶质瘤细胞增殖才能的影响U87MG细胞悬液调理成密度为5×104个/mL，每孔接种100 μL于96孔板中，在CO2培育箱中过夜。为调查知母皂苷AⅢ对U87MG细胞增殖才能的影响，预试验中设置24，48，72 h时刻点，数据差异不大（未显现），终究挑选24 h为MTT检测时刻。知母皂苷AⅢ于125，25，5，10 μmol·L-1剂量处理U87细胞，孵育24 h后，每孔参加 5 g·L-1 MTT（1×PBS为溶剂）溶液20 μL，持续避光培育 4 h，弃上清，每孔参加 150 μL DMSO，37 ℃摇床振摇5～10 min至其充沛溶解，于酶标仪测得在490 nm波长下的吸光度A，核算用知母皂苷AⅢ不同浓度处理的各组细胞的细胞活性。细胞活性率=（A给药组-A空白对照组） / （A对照组-A空白对照组） ×100%。每组独立试验重复3次。

24QRTPCR调查知母皂苷A Ⅲ对细胞凋亡信号通路中p21 mRNA表达的影响为调查知母皂苷AⅢ对细胞周期的影响，检测其对细胞周期阻滞蛋白p21的表达的影响，文献报导知母皂苷AⅢ诱导白血病细胞凋亡时刻为4 h[11]，预试验中比较了4，6，24 h知母皂苷AⅢ诱导p21基因和蛋白表达改变（数据未显现），最終断定4 h检测p21基因表达改变，6 h检测蛋白表达改变。U87MG细胞贴壁过夜培育后，更换为新鲜的无血清DMEM培育液，给药处理组参加知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）持续培育4 h，每组加1 mL Trizol依照Trizol说明书提取进程搜集各组细胞的总RNA，读取和核算各组RNA浓度，加DEPC水将悉数样品的RNA调整至同一质量浓度500 mg·L-1。A260/A280在18～20的样品进行反转录。依照HighCapacity反转录试剂盒说明书，20 μL反转录系统的反响条件为：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，产品置于4 ℃备用。依照RealMasterMix（SYBR Green） 说明书，以20 μL反响系统组成模板cDNA，进行定量反转录聚合酶链式反响（QRTPCR）。引物序列如下：p21 Forward 5′TGAGCCGCGACTGTGATG3′；Reverse 5′GTCTCGGTGACAAAGTCGAAGTT3′； βactin Forward 5′CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC3′；Reverse 5′CGGACTCGTCATACTCCTGCT3′，由生工生物工程（上海）有限公司组成。反响条件为： 95 ℃ 10 min，50 ℃ 2 min，95 ℃预变性15 s，53 ℃ 1 min，扩增40个循环。每组样品均做3个复孔。知母皂苷AⅢ处理组的相对含量用2ΔΔCt核算得出。每组独立试验重复3次。

25Western blot调查知母皂苷AⅢ及按捺剂联用对信号通路中要害蛋白表达含量的影响为调查知母皂苷AⅢ对MAPK信号通路的影响，而蛋白磷酸化水平随时刻改变而改变，终究断定知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1） 处理30 min后，搜集蛋白检测MAPK首要蛋白的磷酸化水平。细胞分为空白对照组、按捺剂联用组为按捺剂联用预处理1 h后参加知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）、按捺剂联用独自处理组、知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）单用组处理6 h，冰镇1×PBS清洗，参加磷酸酶按捺剂、蛋白酶按捺剂和RIPA强细胞裂解液后搜集细胞，超声细胞粉碎机超声破碎（3次，3 s/次），离心机在4 ℃以12 000 r·min-1离心15 min后取上清。依据细胞核蛋白细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书，对细胞核蛋白和浆蛋白进行别离。各组蛋白均用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。电泳前将每组15 μg的蛋白以4∶1的份额参加5×loading buffer，金属浴95 ℃ 2 min后即用10%或12%的SDSPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，用湿转法将蛋白转到NC膜上后，用5%脱脂牛奶或5%BSA溶液关闭1 h，分别用一抗βactin，βCatenin，Cyclin D1，p21，Bcl2，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK，4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜5 min，6次后参加相应二抗（1∶1万）孵育，TBST洗膜5 min，6次后，ECL显影液显影。每组独立试验重复3次。

26统计剖析本试验一切计量材料均以±s标明，两样本组间比较选用t查验，P<005为差异具有统计学含义。

3成果

31知母皂苷AⅢ对裸鼠皮下荷瘤模型的影响与模型组比较，知母皂苷AⅢ处理组的瘤重呈明显性下降（P<005）。而淫羊藿苷Ⅱ、红景天苷、原薯蓣皂苷元处理组的瘤重有必定的下降趋势，但无明显性差异（图1）。Ki67的表达与肿瘤细胞增殖密切相关，临床上Ki67作为点评恶性肿瘤细胞成长的重要目标。与模型组比较，知母皂苷AⅢ处理组的Ki67阳性细胞数明显削减（P<005）。其他组与模型组比较，无明显性差异（图1）。

32知母皂苷AⅢ对U87MG细胞增殖才能的影响不同剂量的知母皂苷AⅢ（125～10 μmol·L-1）和人脑胶质瘤细胞共孵育24 h，知母皂苷AⅢ在25～10 μmol·L-1呈剂量依赖性按捺人脑胶质瘤细胞U87MG的细胞增殖（P<005）（图2）。

33知母皂苷AⅢ对U87MG细胞中 p21 mRNA的影响经知母皂苷AⅢ处理4 h后，p21基因水平的表达呈剂量依赖性进步 （P<001）（图3）。

34Western blot法检测知母皂苷AⅢ对U87MG细胞中βCatenin，Cyclin D1，p21，Bcl2，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK蛋白水平的影响经知母皂苷AⅢ处理6 h 后，p21的蛋白表達上调（P<001），与其基因水平的改变一起。而βCatenin，Bcl2，Cyclin D1经干涉后下调（P<001）（图4）。经知母皂苷AⅢ处理30 min后，ERK蛋白磷酸化水平明显下降（P<001），而p38和JNK蛋白的磷酸化水平明显升高（P<001）（图5）。

35Western blot法检测联用SP600125和SB203580对知母皂苷AⅢ干涉p21和βCatenin蛋白水平的影响细胞分为空白对照组、知母皂苷AⅢ处理组（5，10 μmol·L-1）、JNK按捺剂SP600125（2 μmol·L-1）和p38按捺剂SB203580（20 μmol·L-1） 联用组、按捺剂联用组和知母皂苷AⅢ一起处理组。按捺剂联用组，与空白对照组比较，不影响p21和βCatenin在U87中的蛋白表达；按捺剂联用预处理细胞1 h 后，知母皂苷AⅢ持续处理6 h，抑

与对照组比较1）P<005，2）P<001；与按捺剂联用组比较3）P<005，4）P<001（图2～7同）。

制剂联用和AⅢ 10 μmol·L-1一起处理组与AⅢ 10 μmol·L-1剂量独自运用组比较，p21的蛋白表达明显下调，βCatenin明显上调，反转了AⅢ处理后进步p21和下降βCatenin的蛋白改变趋势（图6）。

36Western blot法检测细胞核和细胞质中对知母皂苷AⅢ干涉βCatenin蛋白水平的影响经知母皂苷AⅢ处理6 h后，知母皂苷AⅢ处理组与空白对照组一起进行细胞核和细胞质蛋白的别离，检测核质内βCatenin蛋白的表达改变。U87MG细胞经AⅢ干涉后，βCatenin的核蛋白表达明显下降（图7）。在AⅢ 10 μmolL-1剂量处理组中，该组的细胞核内βCatenin的蛋白表达比较于空白对照组有明显下降（P<005）。而细胞质中的βCatenin蛋白表达与空白对照组比较无明显改变。

4成果与评论

Wnt/βCatenin信号通路与肿瘤发生等多种疾病的病理进程相关，在多个细胞进程（分解、搬迁、极性和增殖）中发挥重要效果。在胶质瘤安排中，WNT1表达比正常脑安排明显进步，并与Cyclin D1的表达明显相关。Kailiang等依据UCSC癌症基因数据库剖析发现βCatenin和Cyclin D1在人脑胶质瘤细胞中呈高表达状况[12]。βCatenin作为核转运受体，经过与黏附分子相互效果，取得和谐核功用和细胞黏附的特点[13]。熊果酸可经过下降βCatenin的核搬运干涉Wnt/βCatenin信号通路而按捺骨肉瘤的成长[14]。在本研讨中，经知母皂苷AⅢ处理后，

U87MG细胞中βCatenin，Cyclin D1和Bcl2的蛋白表达水均匀呈剂量依赖性下降，且AⅢ 10 μmol·L-1能明显下降βCatenin的核搬运。

周期蛋白依赖性激酶（CDK）按捺剂p21（也称为p21WAF1/CIP1蛋白）是响应于各种影响促进细胞周期阻滞的一个要素，在转录调控调理、按捺细胞凋亡、DNA修正中发挥效果[15]。p21由p53依赖性和p53非依赖性的机制来诱导。在p53非依赖性机制中，在有些情况下，p21具有促进细胞凋亡的效果[16]。成果显现，知母皂苷AⅢ处理后，可于体外明显进步U87细胞中p21在基因和蛋白水平的表达。

丝裂原活化蛋白激酶宗族（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是一种广泛存在于真核生物胞浆中高度保存的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由细胞外信号引发细胞核内反响的一条经典通路，影响着细胞构成、分解、成长、增殖及凋亡等多个生命进程。研讨标明有4条信号通路存在于MAPK宗族中：ERK（extracellular signalregulated kinase）即细胞外信号调理激酶、JNK （cJun Nterminal kinase）即cJun N端激酶、MAPKp38和ERK5/BMK1通路。在哺乳动物中，MKK4（MAP2K4）和MKK7（MAP2K7）磷酸化并激活JNK，而MKK3（MAP2K3），MKK4，MKK6和（MAP2K6）激活p38[17]。ERK是肿瘤细胞成瘾性基因，ERK信号通路与细胞增殖成长密切相关[18]。JNK和p38调理细胞存活（如Bcl2和Bax），细胞周期（如P53和Cyclin D1）和细胞增殖（如JUN和MYC）很多基因的表达[17]。JNK通路参加知母皂苷AⅢ对人黑色素瘤A375细胞[19]和白血病HL60[11]诱导凋亡效果。本试验成果标明，知母皂苷AⅢ呈剂量依赖性下降U87MG细胞中ERK蛋白的磷酸化，一起呈剂量依赖性进步p38和JNK的磷酸化水平。联用JNK按捺剂SP600125（2 μmol·L-1）和p38按捺剂SB203580（20 μmol·L-1）可反转知母皂苷AⅢ在10 μmol·L-1剂量对p21蛋白的进步效果和对βCatenin的按捺效果，而按捺剂联用组对p21和βCatenin的蛋白表达的影响，与对照组比较无统计学差异，成果提示JNK和p38信号通路参加知母皂苷AⅢ按捺U87MG细胞增殖的进程。

综上所述，知母皂苷AⅢ部分经过MAPK和Wnt/βCatenin信号通路，进步p38和JNK蛋白的磷酸化水平，按捺ERK蛋白的磷酸化水平，按捺βCatenin的核搬运，进步p21和按捺Bcl2，Cyclin D1等抗凋亡蛋白的表达，然后按捺人脑胶质瘤细胞U87MG的体外增殖和体内成长。

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