从土壤中别离真菌 玄参内生真菌别离、判定及系统发育剖析
伍晓丽+宋旭红+杨宏国+刘飞+张雪+刘金亮+陈大霞+李隆云
[摘要]别离从武隆产区玄参根、主茎、侧枝、叶片和重庆市区培育玄参侧枝中别离内生真菌，依据形状学特征和26SrDNA D1/D2测序成果对其进行判定，并进行了种群多样性剖析，对优势属炭疽菌属内生真菌构建了体系发育树。试验成果显现：真菌种群多样性指数，武隆玄参叶片>主茎=侧枝>根，重庆玄参侧枝>武隆玄参侧枝。合计别离得到内生真菌58株，绝大部分是各种植物病原菌，其优势属为刺盘孢属Colletotrichum，其间绝大大都是C. gloeosporioides和C. boninense。叶片和子芽或许是内生菌侵染的首要途径；内生菌和病原菌或许彼此转化，受环境、基因型等多种要素影响。
[关键词] 玄参； 内生真菌； 判定； 体系发育剖析
[Abstract] The endophytic fungi from root， main stem， branch and leaf of Scrophularia ningpoensis were isolated and identified from Wulong and Chongqing， and the population diversity analysis and phylogenetic analysis were followed. The result indicated that， as to population diversity index， S. ningpoensis from Wulong： leaf>main stem = branch>root， branch from Chongqing>branch from Wulong. Fifty-eight endophytic fungi were obtained， most of which were the pathogens of the plant. Colletotrichum was the prevailing genus， of which C. gloeosporioides and C. boninense were the prevailing strains. Leaf and seedlings might be the main path of infection. Endophytic fungi and pathogen might convert to each other， influenced by such factors as environment， genotype et al.
[Key word] Scrophularia ningpoensis； endophytic fungi； identification； phylogenetic analysis
玄參为玄参科玄参属植物玄参Scrophularia ningpoensis的枯燥根，始载于《神农本草经》，性微寒，味甘、苦、咸，具有凉血滋阴、泻火解毒的成效，主治热病伤阴诸证，如骨蒸、痨咳、津伤便秘、温毒发斑，及目赤、咽痛、臃肿等[1]。玄参是我国大宗药材品种，市场需求巨大。现在玄参培育以施用化肥为主，多年接连施用影响药材质量，危害土壤肥力，损坏生态环境。而许多植物内生菌对宿主具有显着的促生效果。内生菌（endophyte） 广泛存在于植物各器官、安排细胞内及细胞空隙，其品种随宿主植物品种、植株器官、地域、时节气候而改动，具有丰厚的多样性，国内外相关研讨报导许多[2-5]。有研讨标明，内生菌及其代谢产品具有拮抗、促成长、抗肿瘤等多种活性，可广泛使用于农业、工业、医药范畴[6-9]。玄参内生菌方面的研讨很少，仅见文献报导了玄参块根内生菌产哈巴俄苷的相关研讨，且未清晰判定出内生菌的品种[10]。本研讨对玄参内生真菌进行了别离和判定，并对优势属炭疽菌属内生真菌进行了体系发育剖析，旨在为挑选对玄参具有促成长效果的内生真菌，研制微生物肥料，削减化肥施用奠定根底。一同也提醒了玄参内生真菌的散布规则，为进一步研讨玄参化学成分与内生菌的相关性，挑选活性物质供应前期根底。
1 资料
1.1 试验资料收集
2015年8月，在玄参成长盛期，别离采纳重庆市中药研讨院植物园（以下简称植物园，海拔400 m，北纬29.35°，东经106.33°）人工培育玄参的侧枝和重庆武隆仙女山柳树村玄参基地（海拔1 350 m，北纬 29.43°，东经 107.77°）人工培育玄参全株（叶、主茎、侧枝、根），采回后当即进行内生真菌别离。
1.2 试剂与仪器
Takara9164和RR178试剂盒购自宝生物公司。DYY-6C水平电泳仪，PTC-100 型 PCR仪，Gel Doc XR凝胶成像仪。
1.3 培育基
马铃薯葡萄糖琼脂培育基（PDA）：马铃薯200 g，切碎块，煮汁过滤，加葡萄糖20 g，琼脂粉7 g，定容至1 L。
2 办法
2.1 内生真菌别离与纯化
植物园培育玄参植株上部、中部、下部强健无病虫灾侧枝各取3～5枝，悉数混合后剪3 cm长小段。仙女山玄参植株分解为块根、主茎、侧枝、叶片。块根洗去泥土，悄悄刮去表面薄皮，洗净，切小块；植株主茎上部、中部、下部各取一段（约15～20 cm长）后混合，剪3 cm长小段；植株上部、中部、下部强健无病虫灾侧枝各取3～5枝，悉数混合后剪3 cm长小段；植株上部、中部、下部强健无病虫灾叶片各取4～6片后悉数混合，剪3～4 cm2小块。以上资料用洗衣粉水洗刷2 min，流水冲刷40 min，75%乙醇洗刷1 min，0.1%升汞消毒5 min，无菌水洗刷4次，取最终一次洗刷的洗液数滴于PDA涂布，共接种3皿，作为对照。资料用无菌滤纸吸干后，再次将根块分为1 cm2小薄片，茎段剪0.5～1 cm长小段，叶片切0.5～1 cm2小片，接种PDA。对照和资料均置于25 ℃培育箱，漆黑，培育5～10 d后，挑取安排周围长出的菌丝转接入 PDA平板中纯化，直到得到纯洁无污染的菌落。
2.2 内生真菌判定
2.2.1 形状查询 查询培育的内生真菌菌落形状，对照《真菌判定手册》[11]，依据菌落以及菌丝体和孢子的形状特征进行判定。
2.2.2 分子判定 选用Takara9164和RR178试剂盒对别离出的内生真菌进行基因组 DNA 提取及26S rDNA D1/D2区域序列 PCR扩增。
真菌基因组DNA提取：挑取少数菌丝体于1.5 mL EP管，参加Takara 9164 真菌裂解液50 μL，80 ℃水浴15 min，4 000 r·min-1离心，取上清液作为PCR模板。
PCR（50 μL） 体系：ddH2O 20 μL；PCR premix（Takara） 25 μL；真菌DNA模板 4 μL；D1/D2 Forward Primer和D1/D2 Reverse Primer（Takara）各0.5 μL PCR扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次，72 ℃延伸 10 min。 扩增产品经琼脂糖凝胶电泳检测后送华大基因公司测序。
2.3 种群多样性剖析
界说 ITS-rDNA 序列同源性大于97%，同属菌株作为同一分类单元[12]，核算Shannon-Wiener 指数（H）[13]。H=-∑（Pi）（log2Pi），Pi为样品中归于第i种的个别的份额。
2.4 DNA 序列剖析及体系发育树构建
登陆NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用 BLAST将测序取得的各菌株26S rDNA D1/D2区域序列与GenBank中的已知序列进行比对，查找相似性最高的菌种，结合形状学特征，断定别离菌株的分类位置。并用MEGA6.0 软件依照鄰接法（Neighbour-Joining，N-J），自展数（bootstrap）为 1 000，构建体系发育树。
3 成果与剖析
3.1 玄参内生真菌的别离
内生真菌别离成果见表1，对照平板没有菌成长。内生真菌含量叶片>侧枝>主茎>根。植物园玄参侧枝>武隆玄参侧枝。研讨中还发现，内生真菌的别离效果还遭到培育基、培育温度等要素影响。但整体来说，根部内生菌含量不如茎、叶高。
3.2 玄参内生真菌判定
玄参内生真菌菌落形状及分子判定成果见表2。别离出的内生菌形状多种多样，见图1。
从表2可见，武隆基地玄参内生真菌从品种来看，在一切判定出的41株菌株中，炭疽菌属Colletotrichum有24株，占总数的58.54%；其次是枝穗霉属Clonostachys 6株和茎点霉属Phoma 5株，别离占14.63%，12.2%。在24株炭疽菌属菌株中，有41.67%是胶孢炭疽菌C. gloeosporioides，29.17%是博宁炭疽菌C. boninense。可见炭疽菌属Colletotrichum是武隆玄参内生真菌的优势属，而其间胶孢炭疽菌C. gloeosporioides和博宁炭疽菌C. boninense是优势种。
从散布部位看，叶片中Colletotrichum占绝对优势，占叶片内生真菌总量的71.43%，且以C. gloeosporioides和C. boninense为主；侧枝中Colletotrichum也占绝对优势，占侧枝内生真菌总量的77.78%，依然以C. gloeosporioides和C. boninense为主；主茎中Clonostachys sp.和Phoma sp.各占30%，Colletotrichum数量上占相对弱势；根中的内生真菌仅2种。
各部位横向比较，侧枝和叶片中真菌品种挨近，均以C. gloeosporioides，C. boninense为主，兼有Clonostachys sp.，Glomerella fioriniae，即侧枝中77.78%的真菌与叶片中真菌共同；而主茎中只要55.56%的真菌在叶片中存在；主茎和侧枝共有的真菌不多，仅有C. gloeosporioides，Clonostachys sp.这2种菌在叶片中也存在；主茎、叶片和根均有Phoma sp.。
植物园的玄参茎部内生菌，从品种看，50%是Colletotrichum，其间以C. gloeosporioides为主。可见和武隆玄参侧枝相同，Colletotrichum是优势种属，C. gloeosporioides是优势种。
将植物园的玄参侧枝内生真菌和武隆基地玄参侧枝内生真菌横向比较，C. gloeosporioides 是二者共有的菌，且是相同菌株，均是C. gloeosporioides strain CMT53 和C. gloeosporioides strain HC-73，不过植物园玄参侧枝中的C. gloeosporioides isolate IA11在武隆玄参侧枝中未别离到。
以上真菌，有14株仅判定到属，首要是Phoma sp.，Clonostachys sp.，Penicillium sp.，Phomopsis sp.，阐明这14株或许包含没有发现的新种。
3.3 玄参内生真菌种群多样性剖析
核算多样性指数成果如下：武隆玄参叶片3.268，主茎2.725，侧枝2.725，根1.000，植物园侧枝3.379。以叶片中真菌多样性最高，其次是主茎和侧枝，根部最低。植物园玄参侧枝内生真菌多样性高于武隆基地玄参植株的侧枝。
3.4 玄参炭疽菌属内生真菌体系发育树构建成果
依据前述分子判定成果，选取20个近缘种的菌株，与别离所得炭疽菌属菌株构建体系发育树，成果见图2。
从图2可见， 13株与C. gloeosporioides的不同株系聚到一同；12株与C. boninense的不同株系聚到一同；2株与C. crassipes聚为一枝；各有1株别离与C. abscissum，C. destructivum，C. kahawae，C. fructicola聚为一枝。C. gloeosporioides组可分为4个亚组，以C. gloeosporioides strain HC-73亚组菌株数最多；C. boninense组也可分为4个亚组，以C. boninense CMT17亚组的菌株数最多。
4 评论
4.1 内生真菌的普遍性和多样性
内生菌在植物体中的散布具有普遍性、多样性的特色。在现在研讨过的一切植物中均发现有内生菌[14-15]。各植物体中存在的内生菌的数量、品种受植物的品种、安排、生存环境、成长阶段、养分供应及两者的基因型等多种要素影响[16]。本研讨成果再一次证明了同一植株，不同器官的内生真菌组成不同；相同的器官和选材时节，不同选材地址的玄参侧枝内生真菌组成不同。武隆玄参侧枝内生真菌多样性就远小于植物园玄参侧枝，估测是因为植物园海拔低（400 m左右），气温较高，环境中真菌品种繁复。而武隆基地海提高（1 400 m左右），气温低，环境中真菌品种较少。
4.2 玄参内生真菌侵略途径剖析
内生菌可经过多种途径对宿主植物进行侵染。可从植物叶片的外表皮进入，也可以经过分解植物表皮细胞壁或经过各种天然开口（包含侧根发作处、气孔、水孔等）或创伤等传达途经进入植物[17-21]。就玄参而言，内生真菌浸染植株可以经过几个途径：块根浸染，子芽带菌，茎部侵染，叶部侵染。前述真菌多样性剖析成果和分子判定的成果标明，侧枝中77.78%的真菌与叶片中真菌共同；而主茎中只要55.56%的真菌在叶片中存在；主茎和侧枝共有的真菌仅有C. gloeosporioides，Clonostachys sp.，这2种菌在叶片中也存在；主茎、叶片和根均有Phoma sp.。剖析玄参各部位的特性：根部表皮较细密，除了土壤或昆虫形成的细小创伤，其他部位不利于真菌侵略，且根部安排细密不透气，水分较多，不利于大都真菌定殖；叶片表皮细胞柔软，有许多气孔，合适真菌侵略，且叶片内部安排疏松透气，有必定弱光，水分合适，合适许多真菌定殖；茎部表皮较硬，不合适真菌侵略，但内部疏松透气，水分合适，合适真菌定殖；此外，笔者曾别离子芽内生真菌，得到多达7个菌，和主茎、侧枝带菌量附近。依据以上剖析估测，玄参中大大都内生真菌是从叶片（气孔、创伤等）侵略，经侧枝到主茎，最终进入根部。其次是子芽本身内部带菌以及褶皱带菌侵入幼茎。而根部、主茎、侧枝也可以由细小创伤侵染少数内生真菌。即叶片是玄参内生真菌侵入的首要途径，子芽带菌是非必须途径。由此也可以估测，大大都玄参病原真菌也是由叶片和子芽侵入植株。因而，防备玄参病害，应该首要在叶面喷施药剂，其次，应该挑选强健无病子芽以及对子芽进行灭菌药剂浸泡。
4.3 内生菌和病原菌的联系讨论
现在，植物内生菌较被公认的界说是指那些在其日子史的必定阶段或许悉数阶段日子于健康植物的各种安排和器官内部的真菌或许细菌，被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在症状[22]。它们不只包含了互利共利的和中性的内生共生微生物，也包含了那些埋伏在宿主体内的病原微生物。依据这个概念，内生菌和病原菌的边界就比较含糊。有的内生菌对宿主具有必定毒性，在两边的各种力气处于均衡状况，寄主不会发作显着的病症。假如这种均衡被损坏，比如在宿主植物变老或受环境条件钳制导致反抗才能削弱，则内生菌有或许使宿主致病或按捺宿主植物成长[23-24]，即转化为了病原菌。如Faeth[25]发现，在瘠薄的土地上感染Festuca arizonica的植物显着比没有感染的植株成长慢，而在營养丰厚条件下成长的植株则不存在这种现象。此外，曹抱负等[26]发现健康香蕉叶中的内生真菌首要为C. gloeosporioides，占60.7%；而曾大兴[27]的研讨文献说到，C. gloeosporioides和引起香蕉果实腐朽的香蕉炭疽病菌C. musae在分子水平其实差异很小，至今C. musae是独立的一个种仍是归于C. gloeosporioides依然存在很大争议。这从一个旁边面佐证了内生菌和病原菌其实或许彼此转化。
可见，同一植物中，对有的内生真菌而言，是作为内生菌促进宿主成长、对宿主无影响仍是作为病原真菌导致宿主病害，受地理位置、时节、外界小环境改动、宿主基因型及生理状况、真菌本身基因型及活性等多种要素影响。这反映了天然界真菌与植物联系极其丰厚的多样性、可变性以及动态平衡。可以据此揣度，不少病原菌初期就是以内生菌方法埋伏于宿主细胞中。内生真菌与宿主植物的联系见图3。绝大大都玄参内生真菌是各种植物的病原菌，Phoma sp.仍是玄参叶斑病病原，见表3。玄参大田病害比较严重，估测别离出的内生真菌中或许有一些是玄参的病原菌，在条件不合适迸发时，它们以内生菌的形状埋伏于玄参植株内，当条件合适，即导致玄参病害。
既然在外界条件合适时，内生菌和致病菌是可以彼此转化的，因而，在防治植物病害时，不能一味被动地在病害迸发后施用药剂，而应在充沛研讨发病条件的根底上，经过挑选和培育壮苗、选育抗病品种、改动田间通风透光条件、挑选培育合适的地块等农艺办法防备病害，或在病害发作后经过这些办法促进致病菌向内生菌方向转化，然后医治病害。
下一步笔者拟别离展开别离所得内生真菌对玄参的促成长效果和致病性研讨，以挑选促生真菌，一同进一步研讨内生菌和病原菌的内在联系。
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[责任编辑 吕冬梅]