延龄草的成效 延龄草与吉林延龄草根茎及须根中3种皂苷成分的含量测定
杨印军+孙欣光+杨杰+李齐+张洁+赵阳+马百平+郭宝林
[摘要]比较延龄草与吉林延龄草药材根茎与须根间首要成分的含量差异，运用HPLCCAD一起测定了3种首要成分重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的含量。色谱条件：TSK gel ODS（46 mm×250 mm， 5 μm）色谱柱，乙腈水（43∶57）等度洗脱，流速为1 mL·min-1，进样量为20 μL。电雾式检测器（CAD）：作业气压为35 psi（1 psi=6895 kPa），雾化器温度为35 ℃。3种甾体皂苷杰出别离，线性关系、安稳性、精细度、重复性、加样收回试验均契合中药质量剖析要求。运用IBM SPSS Statistics 20剖析软件进行主成分剖析，成果显现，头顶一颗珠的来历包含了2种延龄草属植物，且吉林延龄草为首要资源；7批延龄草样品和9批吉林延龄草的根茎之间3种皂苷成分的含量存在不显着差异；可是根茎与须根之间3种皂苷成分的含量存在显着的差异。
[关键词]HPLCCAD； 延龄草与吉林延龄草； 根茎与须根； 甾体皂苷； 含量测定； 主成分剖析
[Abstract]To compare the differences of main components between in rhizoma and fibrous root of Trillium tschonoskii and T kamtschaticum， a simple， accurate and reliable high performance liquid chromatography coupled with the charged aerosol detector （HPLCCAD） method was developed and then successfully applied for simultaneous quantitative analysis of three compounds， including polyphyllin Ⅶ （T1），pennogenin 3OαLrhamnopyranosyl（1→2） [αLrhamnopyranosyl（1→4）]βDglucopyranoside （T2），polyphyllin Ⅵ （T3）， in 16 batches of rhizome and 14 batches of fibrous root The analytes were well separated from other constituents on TSK gel ODS （46 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrilewater （43∶57） at a flow rate of 10 mL·min-1 The injection volume was 20 μL The nitrogen inlet pressure for the CAD system was 35 psi and the nebulizer chamber temperature was 35 ℃The method was validated for linearity （r>0999 0）， intra and interday precision （029%30%）， repeatability （045%14%）， stability （19%26%）， recovery （1001%1002%， 12%18%）， limits of detection （0002 g·L-1）， and limits of quantification （0005 g·L-1）The obtained datasets were processed by principal component analysis （PCA） and it showed that there was almost no difference in rhizoma of T tschonoskii and T kamtschaticum from different areas of China However， the 3 major compounds existed in rhizoma were different from those in fibrous root of T tschonoskii and T kamtschaticum
[Key words]HPLCCAD； Trillium tschonoskii and Trillium kamtschaticum； rhizoma and fibrous root； steroid saponin； determination； principal component analysis （PCA）
延龄草为百合科延龄草属植物，全世界共有约50种，我国有3种，即延龄草Trillium tschonoskii Maxim、吉林延龄草T kamtschaticum Pall，散布于吉林、西藏延龄草T govanianum Wall（仅见于西藏卡马河下流）[1]。其间，延龄草T tschonoskii被《湖北省中药材规范》录入，药材名头顶一颗珠，又叫芋儿七、佛手七、狮儿七等，药用部位为根及根茎。其味甘、性平、有小毒，有延年益寿的成效，主治头晕目眩、跌打损伤、神经衰弱、高血压病和脑震荡后遗症等疾病，为土家族常用药材[23]。本课题组在进行头顶一颗珠的产地和商场资源查询时发现，现在河北安国、安徽亳州、四川成都和广西玉林等药材商场流转的头顶一颗珠药材均为来自吉林的吉林延龄草，安徽亳州商场的药材也以黑龙江产為主，中药材天地网诚笃通渠道出售的头顶一颗珠也是吉林延龄草，标明头顶一颗珠药材的来历值得研讨。
延龄草中首要的化学成分为甾体皂苷，黄酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等[4]，现在已有延龄草药材中总皂苷及首要甾体皂苷成分含量测定的研讨报导[56]，但迄今为止没有有吉林延龄草的质量研讨和相关报导。本研讨运用HPLCCAD测定2种延龄草药用部位（根状茎和须根）中重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ等3种首要皂苷的含量，其间重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷Ⅵ也是重楼中的重要活性成分[78]。一起，运用统计学办法剖析几个重要产区的延龄草与吉林延龄草之间及根茎与须根之间化学成分的差异，为延龄草属药材合理运用及质量点评供给了科学根据。
1资料
11试验样品
药材来历信息见表1，经我国医学科学院药用植物研讨所郭宝林研讨员判定为百合科延龄草属植物延龄草T tschonoskii和吉林延龄草T kamtschaticum，对1份样品中一起有根状茎和须根的，分隔2个部位测定。
12药品及试剂
对照品重楼皂苷Ⅶ（T1），偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖（T2）、重楼皂苷Ⅵ（T3）均为本课题组从延龄草中别离得到，HPLC面积归一化法测得纯度均≥98%。
乙腈（色谱纯）购于美国Fisher公司；蒸馏水购于广州屈臣氏有限公司。
13首要仪器
Waters 2695剖析型高效液相色谱（Empower作业站），装备有Waters 2487 DAD检测器，ELSD检测器（2000ES，Alltech，USA），CAD检测器（Corona Ultra，Thermo Fisher，USA）；TP 600超声波清洗机（天鹏电子新技术有限公司）；BP 211D 1/10万天平（德国Sartorius公司）。
2办法与成果
21对照品溶液制备
别离精细称取3种对照品各1250 mg于5 mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，即得250 g·L-1的各對照品储藏液，并依照T1T2T3（1∶2∶2）配制成含T1，T2，T3别离为05，100，100 g·L-1的混合对照品储藏液。
22供试品溶液制备
准确称取枯燥药材粉末（过40目筛）05 g于50 mL具塞锥形瓶中，精细参加50 mL 80%甲醇溶液，称重，浸泡30 min，常温下超声提取（功率500 W，频率40 kHz）40 min，放冷，用80%甲醇溶液补足失重，摇匀，022 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
23色谱条件
色谱柱TOSOH TSKgel ODS100V （46 mm×250 mm，5 μm）；活动相乙腈水（43∶57），等度洗脱15 min；流速10 mL·min-1；电雾式检测器（CAD）作业气压35 psi（1 psi=6895 kPa）、雾化器温度35 ℃；进样量20 μL。色谱图如下图1。
24办法学查询
241线性关系精细汲取各混合对照品储藏液25，50，100，250，500，750，1 000 μL别离置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混合规范品溶液。依照23项下条件进样20 μL测定，以峰面积（Y）对对照品浓度（X，mg·L-1）进行线性回归，得各对照品回归方程、相关系数及线性规模。以信噪比S/N=3为基准，测得最低检测限，以信噪比S/N=10为基准，测得最小定量限，成果见表2。
242精细度试验精细汲取对照品溶液按23项下色谱条件，于同1 d内接连进样6次，记载峰面积。成果显现，对照品重楼皂苷Ⅶ，偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的日内峰面积 RSD别离为062%，041%，029%；接连3 d内每天接连进样6次，测得日间峰面积RSD别离为30%，18%，21%，标明仪器精细度杰出。
243重复性试验取样品粉末（JR1）6份，别离按22项下办法制备供试品溶液，按23项下色谱办法测定，核算样品中重楼皂苷Ⅶ，偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ含量的RSD别离为14%，045%，058%，成果标明试验重复性杰出。
244安稳性试验取同一份供试品溶液（JR1），别离于0，2，4，8，12，24 h进样测定。核算重楼皂苷Ⅶ，偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ峰面积的RSD别离为26%，19%，19%，成果标明供试品溶液在24 h内安稳。
245加样收回率试验取已知含量的供试品粉末（JR1）9份，每份各约 025 g，精细称定，别离置于50 mL离心管中，精细参加含T1，T2，T3别离为15，55，62 g·L-1的混合规范溶液800，1 000，1 200 μL，依照21项下办法平行制备，23项下色谱办法测定，测得T1，T2，T3的均匀收回率见表3，成果标明该办法的准确性杰出。
25样品的含量测定
样品测定成果见表4。成果显现延龄草及吉林延龄草根茎中重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的量为451～1357，1228～3347，1452～4006 mg·g-1；延龄草及吉林延龄草须根中重楼皂苷Ⅶ的量为587～1825 mg·g-1，而偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖和重楼皂苷Ⅵ在本试验条件下仅可在部分须根样品检测到。
26成果剖析
以延龄草及吉林延龄草根茎中3种甾体皂苷的含量为根底，选用IBM SPSS Statistics 20剖析软件进行主成分剖析，制成散点图，见图2。相同地，以延龄草及吉林延龄草根茎和须根中3种甾体皂苷的含量为根底，选用该剖析软件进行主成分剖析，成果见图3。图2中不同产地延龄草及吉林延龄草根茎各样本相互稠浊散布，阐明二者之间无显着差异。其间陕西产一份延龄草样品（YR5）未检测到重楼皂苷Ⅵ，而黑龙江产吉林延龄草（JR4）中重楼皂苷Ⅵ含量十分高，然后与其他样品差异较显着。图3成果可见，根茎样本与须根样本能够根本分为2类，
不同部位之间差异比较显着。
3评论
31样品提取条件的优化
样品提取过程中查询了超声提取法和加热回流提取法，经过比较3种待测成分的峰面积发现，二者提取作用适当，故挑选操作简洁、快速的超声提取法。超声提取法中，别离查询了提取溶剂（60%甲醇、80%甲醇、无水甲醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇）、提取物料比（1∶25，1∶50，1∶75，1∶100）、提取时刻（20，40，60 min）对待测成分提取率的影响。终究优化的提取条件为80%甲醇作提取溶剂，提取物料比为1∶100，超声提取40 min。
32检测器的挑选
甾体皂苷一般用蒸发光散射检测器（ELSD）
作为通用型检测器，但其灵敏度较低。电雾式检测器（CAD）相同作为通用型检测器，且具有较高的灵敏度正得到广泛运用[910]。文献报导[6，11]，待测3种甾体皂苷在203 nm下有紫外吸收，本试验查询了DAD，ELSD及CAD 3种检测器的灵敏度，检测限依次为032，021，004 μg，定量下限依次为056，038，010 μg。所以，本文挑选了灵敏度高的CAD检测器。
33延龄草和吉林延龄草药材比较
延龄草和吉林延龄草植物形状差异显着，但药用部位为根茎和须根的头顶一颗珠药材难以从形状上差异和断定来历物种，《中华本草》记载的头顶一颗珠也是来历于这2个物种，药材形状也未加差异[12]。《我国植物志》记载延龄草T tschonoskii散布于云南、四川、湖北、安徽，陕西的秦岭以南，吉林延龄草T kamtschaticum散布于吉林，地理散布上是彻底不同的。为了进一步找到差异二者的办法，本研讨组尝试了DNA条形码判定办法，根据ITS2序列无法差异二者。因而本文从来历散布上开始确定延龄草和吉林延龄草样品（部分来自于商场的样品则与出售商仔细交流确认了来历的产地）。本文实践的查询发现，因为延龄草散布局限于1 600 m以上的高海拔区域，在湖北和重庆更是要2 000 m以上才成长，资源量很稀疏，而吉林延龄草资源较多，所以头顶一颗珠或许一向是以吉林延龄草为干流的。从本文测定的16份样品中3种首要皂苷成分的含量上看，二者没有不同，主张湖北省藥材规范修订时添加来历物种为2个种。
34延龄草根茎和须根的成分含量比较
2种延龄草的根茎与须根的比较成果显现，二者存在较大差异。在15批（除YR5）根茎样品中，所测3种成分均存在，其间偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重楼皂苷Ⅵ的含量均比重楼皂苷Ⅶ高，别离是重楼皂苷Ⅶ含量的226～412倍、289～480倍。但在14批须根样品中均未检测到重楼皂苷Ⅵ，仅有5批样品一起检测到重楼皂苷Ⅶ和偏诺皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖。而且14批须根样品中，重楼皂苷Ⅶ的含量均最高，其间11批高于同批次根茎中的含量，是根茎中的含量145～253倍。一起发现重楼相关研讨中也有报导，重楼须根中重楼皂苷Ⅶ的含量显着高于根茎中的含量[13]。湖北省药材规范中规则的药材来自于根和根茎，可是本文搜集的样品中有2份是仅有根茎而无须根的，因2个部位的成分构成上存在差异，主张应有所差异。
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