中段尿培育有临床意义的是 AGR2、Lgr5在结直肠癌中的表达及其临床意义

刘丽娜+殷云勤+张兆美+席玉

[摘要] 意图 评论AGR2和Lgr5在人CRC中表达及其与临床病理特征的联系，点评二者联合检测对CRC确诊的含义。 办法 选用免疫组化SABC法检测70例CRC安排和20例癌旁正常安排中AGR2和Lgr5的表达状况。成果 ①CRC安排中AGR2阳性表达率较癌旁正常安排显着性增高（68.57%、25.00%，P﹤0.01）。在CRC安排中，AGR2的阳性表达率与肿瘤分解程度与淋巴结搬运呈显着相关（P﹤0.05）。②CRC安排中Lgr5阳性表达率较癌旁正常安排显着性增高（74.29%、40.00%，P﹤0.01）。在CRC安排中，Lgr5的阳性表达率与肿瘤分解程度、滋润深度和淋巴结搬运有显着相关性（P﹤0.05）。③联合检测AGR2、Lgr5曲线下面积与独自检测比较，差异有统计学含义（P均﹤0.05）。定论 AGR2、Lgr5在CRC的发作、开展进程中发挥了重要效果，两者联合检测有助于对CRC患者肿瘤开展的判别，为CRC患者的分子确诊和医治供给了理论支撑。

[关键词] 结直肠肿瘤； AGR2； Lgr5； 免疫安排化学

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）14-0008-04

近年来我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病和逝世呈逐年上升趋势[1]，发病率和逝世率显着高于国际平均水平[2]。现在从分子水平上探究CRC的发作机制、侵袭搬运的分子根底已成为CRC研讨的热门。人前梯度蛋白AGR2（Anterior Gradient-2，Agr2）作为人类前期阶段前后位分解的相关蛋白，是来源于非洲爪蟾蛋白XAG2的人型同系物[3]。很多研讨标明，AGR2与多种肿瘤的生成和搬运具有密切联系，关于AGR2对肿瘤的调控效果和机制， 已成为现在肿瘤研讨范畴的又一重要热门[4]。富含亮氨酸的G蛋白偶联受体（leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5， Lgr5）作为Wnt通路的方针基因，结合R-脊椎蛋白可以使Wnt/β-catenin信号增强， 然后参加了断肠癌等肿瘤的发作[5]。最近研讨还发现[6，7]，Lgr5+干细胞或许是CRC开始细胞，并与CRC的搬运、复发以及患者的预后密切相关。本研讨选用免疫组化办法检测AGR2、Lgr5在CRC及癌旁正常安排中的表达状况，旨在评论AGR2、Lgr5在CRC发作开展进程中的效果，开始点评二者联合检测对CRC临床病理确诊的含义，为CRC的分子确诊和医治供给理论依据。

1材料与办法

1.1一般材料

搜集山西医科大学榜首临床医院病理科2010年1月～2011年12月间CRC患者的白腊标本70例，一起对标本的临床病理参数进行剖析，其间男28例， 女42例， 年纪29～82岁，平均年纪63.7岁；病理分型中高分解17例， 中分解38例，低分解15例；滋润未及浆膜29例，滋润至浆膜层和浆膜层外41例；无淋巴结搬运者39例， 有淋巴结搬运者31例。癌旁安排20例，取自上述CRC标本肿块边际距肿块5 cm或以上正常结直肠黏膜安排白腊标本，均经病理证明无癌滋润，其间男8例，女12例，年纪31～59岁，平均年纪45.7岁。一切CRC患者术前3个月均未行化疗或放疗查看，且在外其他消化道疾病和其他器官肿瘤病史。

1.2 试剂

兔抗人AGR2蛋白多克隆抗体购自美国的Proteintech Group Inc公司，兔抗人Lgr5单克隆抗体为Dako公司产品，SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自武汉博士德生物公司。

1.3 办法

选用免疫组化SABC法。试验进程依照试剂盒阐明进行，切片惯例脱蜡至水，枸橼酸盐高温高压修正抗原，一抗AGR2多克隆兔抗，稀释份额为1∶300，37℃孵育1h；一抗Lgr5单克隆抗体，稀释份额为1∶400，4℃过夜孵育。运用DAB显色，运用苏木精比照染色，最终显微镜下调查染色成果。

1.4 成果断定规范

AGR2蛋白染色以细胞质呈现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。染色评分规范依照上色强度及上色细胞数归纳核算，并参照许良中和杨文涛的办法断定成果[8]。每张切片阳性细胞的染色强度按无色、浅黄色、黄色、棕黄色别离计为0、1、2、3分；阳性细胞数计分：无阳性细胞为0分、1%～10%为1分、11%～50%为2分、51%～80%为3分、≥81%为4分；以上两项的乘积0～3分为阴性，4分及以上均为阳性。（4～5分为轻度阳性，6～9分为中度阳性，10分以上为强阳性）。Lgr5蛋白染色以细胞膜和细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。在每张切片中随机选取5个高倍镜视界（×200），其间每视界以200个肿瘤细胞计数，最终以阳性细胞占总细胞数百分数<10%的判为染色阴性。

1.5统计学处理

一切数据均运用 SPSS 17.0 软件包进行统计学处理。计数材料选用相对数标明，样本率之间比较用χ2 查验或 Fishers准确概率法。P﹤0.05为差异有统计学含义。

2 成果

2.1 AGR2蛋白免疫组化检测成果

2.1.1 AGR2蛋白的表达和散布 AGR2染色首要定坐落细胞质，呈黄色或棕黄色。AGR2在癌旁正常安排细胞中无表达或弱阳性表达，见封三图1 A；在CRC肿瘤细胞呈阳性（见封三图1B）或强阳性表达（见封三图1 C、D），染色散布呈异质性，表现为片状、灶状或散在散布，肿瘤细胞间质无上色。AGR2在CRC安排的阳性表达率（48/70，68.57%）显着高于在癌旁正常安排的阳性表达率（5/20，25.00%），两者差异有统计学含义（χ2=12.198，P﹤0.01），见表1、封三图2。

2.1.2 不同临床病理特征的CRC安排中AGR2蛋白表达比较 在CRC安排中，AGR2蛋白的阳性表达与患者的性别、年纪、滋润深度无相关性（P>0.05），与癌安排的分解程度及淋巴结搬运相关（P﹤0.05）；AGR2在高分解、中分解和低分解安排中的阳性表达率别离为41.18%（7/17）、73.68%（28/38）和86.67%（13/15），差异有统计学含义（P﹤0.05）；有淋巴结搬运（26/31，83.87%）的AGR2蛋白表达率显着高于无淋巴结搬运（22/39，56.41%）的组别，且差异有统计学含义（P﹤0.05）。见表2。

2.2 Lgr5蛋白免疫组化检测成果

2.2.1 Lgr5蛋白的表达和散布 Lgr5染色大多定坐落细胞质中，部分可细胞质和细胞膜一起上色，呈棕黄色细颗粒状。Lgr5在癌旁正常安排中无表达或弱表达，见封三图3A，在CRC安排中则呈高表达，见封三图3B，染色散布呈局灶、簇状散布或呈充满片状散布。Lgr5在CRC安排的阳性表达率（52/70， 74.29%）显着高于在癌旁正常安排的阳性表达率（8/20，40.00%），两者差异有统计学含义（χ2=8.229，P=0.004），见表3、封三图4。

2.2.2 不同临床病理特征的CRC安排中Lgr5蛋白表达的比较 在CRC安排中，Lgr5蛋白的阳性表达与患者的年纪、性别无显着相关（P>0.05），与肿瘤分解程度、滋润深度、淋巴结搬运相关（P﹤0.05）；肿瘤低分解（12/15，80.00%）、浸及浆膜及浆膜外（35/41，85.37%）、有淋巴结搬运（28/31，90.32%）的Lgr5蛋白表达别离显着高于高分解（8/17，47.06%）、未及浆膜（17/29，58.62%）、无淋巴结搬运（24/39，61.54%），且差异均有统计学含义（P﹤0.05）。见表2。

2.3 AGR2、Lgr5对CRC确诊的点评

见表4、封三图5。①AGR2确诊CRC的曲线下面积（AUC）为0.718（95%CI 0.613～0.808），其灵敏度为68.57%，特异度为75.00%；②Lgr5的AUC为0.671（95%CI 0.564～0.767），灵敏度为74.29%，特异度为60.00%；③联合检测AGR2和Lgr5，AUC为0.811（95%CI 0.714～0.886），灵敏度为77.14%，特异度为95.00%；④运用Medcalc软件进行AUC比较，独自检测与联合检测AGR2、Lgr5，差异均有统计学含义（P均<0.05）；而AGR2、Lgr5的AUC比较，差异无统计学含义（P>0.05）。因而，联合检测安排中AGR2、Lgr5的阳性率可显着提高CRC确诊的灵敏度及特异度。

3 评论

3.1 AGR2与Lgr5概略

AGR2源自非洲爪蟾蛋白XAG2（Xenopus anterior gradient 2）人型同系物，与爪蛙外胚层的发育进程及前期阶段前后位的分解有关[9]。AGR2 mRNA在人前列腺、乳腺、结肠及胰腺安排的排泄上皮细胞表达，其蛋白首要定位在排泄上皮细胞的细胞质中，是一种排泄性蛋白[10]。本研讨调查到AGR2表达首要坐落结直肠安排的腺上皮细胞，以细胞质表达为主，且以腺腔面表达为主，这也证明了AGR2蛋白具有排泄特性。

Lgr5是近年来新发现的一种新的7次跨膜G蛋白耦联受体宗族成员[11]，含7次a螺旋跨膜区和17个富含亮氨酸重复序列，其间N-和C-结尾尾部富含半胱氨酸序列， 可在胃肠道、毛囊等多种安排中表达。最近研讨还发现，Lgr5是肠道干细胞的特异性分子符号物，并可在CRC中呈现过表达，因而猜想它或许是一种CRC的干细胞符号物[12]。

3.2 AGR2蛋白与CRC

本研讨成果显现，AGR2蛋白在CRC安排的阳性表达率（48/70，68.57%）较癌旁正常安排的阳性表达率（5/20，25.00%）显着增加。经过剖析CRC安排中AGR2表达与患者临床病理特征发现，AGR2表达与肿瘤安排的分解程度密切相关，低分解CRC安排AGR2阳性率较高分解CRC显着增高，标明肿瘤分解程度越低，AGR2表达量越高。研讨还发现，AGR2表达与CRC淋巴结搬运密切相关，AGR2在31例有淋巴结搬运中的阳性表达率（83.87%）显着高于无淋巴结搬运的阳性表达率（56.41%）。上述成果与Valladares等[7]的研讨成果共同，他们发现部分CRC肿瘤安排中AGR2的mRNA水平上调，一起高搬运性肿瘤的循环肿瘤细胞中表达显着上调，阐明AGR2是一种肿瘤搬运诱导蛋白。Kim等[13]也进一步证明，AGR2基因在黏液性CRC中cDNA含量较非黏液性CRC上调3.3倍，AGR2的过表达与患者预后差显着相关。上述成果均提示，AGR2在CRC中高表达，其反常表达或许在CRC的发作开展中发挥了必定效果，可作为一种有潜在价值的肿瘤分子标志物。但这种AGR2蛋白在CRC安排中表达上调的机制有待进一步研讨。本研讨还发现AGR2蛋白表达与年纪、性别、滋润深度及TNM分期均无显着相关性（均P﹥0.05），与文献报导共同[7]。

3.3 Lgr5与CRC

现在研讨发现，Lgr5的过表达或许参加CRC的发作，但是否参加CRC开展及肿瘤搬运尚存争议。Ziskin等[14]曾对891例CRC安排中Lgr5进行检测，成果发现Lgr5的表达与肿瘤的侵袭性及预后无关。而Walker等[15]却提出Lgr5表达下调后，肿瘤细胞增殖、滋润和搬运的才能反而增强，所以以为Lgr5表达上调与肿瘤细胞黏附力增强和致瘤性下降有关。本研讨选用免疫组化办法对CRC安排和正常安排进行检测，成果发现在CRC安排中Lgr5蛋白的阳性表达率显着高于癌旁正常安排（χ2=8.229，P=0.004），成果还显现，Lgr5蛋白表达与肿瘤分解程度、滋润深度、淋巴结搬运有关（均P﹤0.05），而与年纪、性别无显着相关性（均P﹥0.05）。本研讨成果与Takahashi[16]及Wu等[17]成果相共同，均提示Lgr5表达上调或许促进了CRC恶性转化、侵袭及搬运，关于CRC开展发挥了重要效果，因而Lgr5可作为一个判别CRC患者肿瘤开展的目标，但关于Lgr5参加CRC开展的机制尚不清晰，仍有待进一步深入研讨。