槐杞黄颗粒 呼应面法优选银槐解毒颗粒提取工艺
张江++张丽++木卡代斯?斯依提++赵翡翠
摘要：意图 优选银槐解毒颗粒提取工艺。办法 在单要素试验基础上，选用呼应面法调查提取时刻、料液比、浸泡时刻对银槐解毒颗粒中绿原酸、总黄酮提取办法的影响。选用HPLC一起测定绿原酸、总黄酮的含量，活动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～20 min，13%A；20～30 min，13%～18%A；30～55 min，18%～20%A；55～65 min，20%～23%A），绿原酸和黄酮类成分的检测波长别离为327、256 nm。成果 最佳提取工艺条件为浸泡时刻60 min，加12倍量水，提取130 min，提取2次。绿原酸、芦丁、黄芩苷均匀浓度别离为51.497、68.872、25.763 ?g/g，均匀浸膏得率为33.105%。定论 优化后的提取工藝安稳可行，可为银槐解毒颗粒后续出产供给数据支撑。
关键词：银槐解毒颗粒；绿原酸；芦丁；黄芩苷；呼应面剖析法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.014
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）01-0064-05
Optimization of Extraction Process of Yinhuai Jiedu Granula by Response Surface Methodology
ZHANG Jiang1， ZHANG Li2， Mukadaisi SIYITI1， ZHAO Fei-cui3
1. College of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China；
2. Examination and Verification Center for Food and Drug in Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China；
3. Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China
Abstract： Objective To optimize extraction process of Yinhuai Jiedu Granula. Methods On the basis of single factor experiments， effects of soaking time， solvent dosage and extracting time on contents of chlorogenic acid and total flavonoids were investigated by response surface methodology. HPLC was used to determine contents of chlorogenie acid and total flavonoids with mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid for gradient elution （0–20 min， 13%A； 20–30 min， 13%–18%A； 30–55 min， 18%–20%A； 55–65 min， 20%–23%A） and detection wavelengthes of 327 nm and 256 nm for chlorogenic acid and total flavonoids respectively. Results Optimal extraction process was as following： soaked 60 minutes and extracted twice with 12 times the amount of water per time of 130 minutes. Concentrations of chlorogenic acid， rutin and baicalin were 51.497， 68.872， 25.763 ?g/g respectively. The average extract yield was 33.105%. Conclusion The optimized extraction process is feasible and stable， which can provide data support for the further research on Yinhuaijiedu granula.
Keywords： Yinhuai Jiedu Granula； chlorogenic acid； rutin； baicalin； response surface
银花散为新疆医科大学隶属中医医院院内制剂，为该院刘红霞教授多年临床实践的经验方，由金银花、槐花、黄芩等15味药组成，具有清热解毒、消痈散结之成效，临床用于医治肺胃湿热所造成的的寻常型痤疮、酒渣鼻、酒渣样皮炎、脂溢性皮炎。方中金银花、槐花、黄芩为君药。研讨标明，金银花水提液体
基金项目：乌鲁木齐市科学技术计划（Y151310012）
通讯作者：赵翡翠，E-mail：1017987429@qq.com
内或体外均具有显着的抑菌、抗菌作用[1-3]；槐花中的芦丁、槲皮素等黄酮类化合物是其首要药理活性成分[4-6]，有抗病毒、抗真菌、止血、降压、扩冠等作用[7]；黄芩苷是黄芩及其制剂的首要质量操控目标成分[8-9]，具有极为广泛的药理活性，包含抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤、保肝、维护汗水管及神经系统等多种作用[10]。因为银花散口感较差，且该处方药味较多，故拟将银花散改剂型为颗粒剂。银槐解毒颗粒是在银花散基础上开发研发而成。结合中试出产成本，挑选水为提取溶媒，以绿原酸、芦丁、黄芩苷质量浓度的归纳评分为点评目标，经过呼应面法对提取工艺条件进行优化，为中试出产供给数据支撑。endprint
1 仪器与试药
1525型高效液相色谱仪（包含2489型PAD检测器、Empower Pro工作站，美国Waters公司），Centra-20型紫外-可见分光光度计（GBC科学仪器有限公司），AG-135型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），KDM型调温电热套（山东鄄城光亮仪器有限公司），DZKW-S-4型电热恒温水浴锅（北京永光亮医疗仪器有限公司），GZX-GF101-2-BS-Ⅱ/H型电热恒温鼓风枯燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）。
绿原酸对照品（批号110753-201415，供定量测定用，质量分数以96.2%计）、芦丁对照品（批号100080-201409，供定量测定用，质量分数以91.9%计）、黄芩苷对照品（批号110715-201016，供定量测定用，质量分数以94.0%计），我国食物药品检定研讨院；乙腈为色谱纯；其他试剂均为剖析纯。
金银花、槐花、黄芩等饮片购自新疆玖元堂中药饮片有限责任公司，经新疆维吾尔自治区中医医院李永和主任中药师判定，均契合2015年版《中华人民共和国药典》相关项下要求。
2 办法与成果
2.1 提取办法
取金银花、槐花、黄芩等饮片，参加10倍量水，浸泡1 h，提取2次，每次2 h。检测提取液中绿原酸、芦丁、黄芩苷的含量，以及浸膏得率，核算归纳评分。
2.2 绿原酸、芦丁、黄芩苷定量测定办法的树立
2.2.1 色谱条件
XTerra C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；以乙腈为活动相A，以0.1%磷酸溶液为活动相B，梯度洗脱（0～20 min，13%A；20～30 min，13%～18%A；30～55 min，18%～20%A；55～65 min，20%～23%A）；流量1.0 mL/min；进样量10 ?L；柱温30 ℃；绿原酸检测波长为327 nm，黄酮类成分检测波长为256 nm。色谱图见图1。
2.2.2 混合对照品溶液的制备
精细称取绿原酸、芦丁、黄芩苷对照品适量，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇配成浓度别离为0.50、0.54、0.30 mg/mL的对照品溶液。加甲醇别离制成必定浓度的混合溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备
依照各试验参数规划对药材进行提取，放冷，将提取液经纱布过滤，取滤液20 mL蒸干，加甲醇5 mL溶解，经0.22 ?m微孔滤膜过滤，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备
按处方量称取除掉金银花或黄芩的样品，按“2.2.3”项下办法制备，即得。
2.2.5 规范曲线的树立
取混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，别离进样1、4、8、10、12、14 ?L，以峰面積为纵坐标，质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，制作规范曲线，核算回归方程。绿原酸Y=13 601 155.63X+435 940.02（r=0.999 0），线性规模0.50～7.00 ?g；芦丁Y=18 925 224.34X-273 481.69（r=0.999 7），线性规模2.16～7.56 ?g；黄芩苷Y=20 884 554.03X-21 504.29（r=0.999 4），线性规模0.30～4.20 ?g。
2.2.6 精细度试验
精细汲取混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件接连进样6次，核算绿原酸、芦丁、黄芩苷峰面积的RSD别离为1.74%、1.84%、2.58%，标明仪器精细度杰出。
2.2.7 安稳性试验
精细汲取同一供试品溶液，别离在0、2、4、8、12、24 h进样10 ?L，记载色谱峰面积，核算绿原酸、芦丁、黄芩苷峰面积的RSD别离为1.67%、2.48%、1.71%，标明供试品溶液在24 h内安稳性杰出。
2.2.8 重复性试验
按处方量精细称取饮片6份，按“2.2.3”项下办法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记载色谱峰面积，核算绿原酸、芦丁、黄芩苷峰面积的RSD别离为0.18%、1.81%、1.62%，标明该办法重复性杰出。
2.2.9 加样回收率试验
取已知浓度的待测溶液6份，别离精细参加绿原酸、芦丁、黄芩苷2.85、3.60、1.55 mg，按“2.2.3”项下办法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，其均匀回收率别离为101.13%、102.74%、101.99%，RSD别离为1.86%、1.67%、1.89%。成果标明，本办法有杰出的回收率。
2.3 浸膏得率测定
精细量取供试品溶液50 mL，置于已安稳质量的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干，搬运至烘箱内，105 ℃枯燥至安稳质量，取出，置枯燥器中冷却至室温，敏捷精细称定质量，核算浸膏得率。
2.4 单要素试验
2.4.1 提取次数开始调查
将加水倍数固定为10倍，浸泡时刻固定为1 h，提取时刻固定为2 h，别离按1、2、3次进行提取，成果归纳评分在1～3次呈添加趋势，但提取2次与3次相差不大，见图2。结合实际出产状况，选取2次作为呼应面试验规划的提取次数。
2.4.2 提取时刻开始调查
将提取次数固定为2次，加水倍数固定为10倍，别离按1、1.5、2、2.5 h进行提取，成果归纳评分在1～2 h呈添加趋势，在2～3 h呈递减趋势，见图3。故2 h为最佳提取时刻。
2.4.3 浸泡时刻开始调查
将提取次数固定为2次，加水倍数固定为10倍，提取时刻固定为2 h，按浸泡时刻0.5、1、1.5、2、2.5 h进行提取，成果归纳评分在0.5～1 h呈添加趋势，在1～2.5 h呈递减趋势，见图4。故1 h为最佳浸泡时刻。endprint
2.4.4 加水倍数开始调查
将提取次数固定为2次，提取时刻固定为2 h，加水倍数别离按8、10、12、14、16倍进行提取，成果归纳评分在8～10倍呈添加趋势，在10～14倍呈递减趋势，见图5。故10倍为最佳加水倍数。
2.5 提取工艺优选
2.5.1 呼应面试验规划
在单要素试验基础上，按处方量精细称取饮片，根据各要素的特色及影响程度，断定归纳评分=绿原酸×0.4+总黄酮×0.4+浸膏得率×0.2（总黄酮=芦丁×0.5+黄芩苷×0.5），挑选提取时刻（A）、浸泡时刻（B）、加水倍数（C）为自变量，绿原酸、芦丁、黄芩苷含量为因变量，选用Design-Expert8.0.4软件Central Composite试验规划计划进行研讨，成果见表1。
2.5.2 模型的拟合
选用方差剖析对各要素进行多元二次回归，得回归方程Y=80.72+1.56A+0.70B+2.79C-0.16AB+0.37AC-0.58BC-1.91A2-0.19B2-1.29C2。从表2能够看出，A、C、A2、C2具有明显影响，影响程度为C>A>B；失拟项P>0.05，标明失拟不明显；r=0.940 8，标明该模型拟合较好，试验误差小，可用该模型对不同条件下的试验成果进行测定。根据回归剖析成果制作三维呼应面图，见图6。
2.5.3 验证试验
经过对数据的归纳剖析，最佳提取工艺为：浸泡时刻63.28 min，加12倍量水，提取时刻135.01 min；结合实际出产断定最佳工艺为浸泡60 min，加12倍量水，提取130 min。按处方量称取3份饮片，每份176 g（其间金银花、槐花、黄芩各10 g），按优选的提取工艺进行3次验证试验，成果绿原酸、芦丁、黄芩苷均匀质量浓度别离为55.28、69.26、26.78 ?g/g；浸膏得率为33.72%，归纳评分与猜测值的误差为1.66%，标明该二项式模型拟合作用杰出，可信度较高。
3 评论
本研讨在单要素试验中经过调查多个水平，筛选出各要素的最佳提取计划，缩小进入呼应面规划试验的规模；在工艺的优选上，固定提取次数为2次，以浸泡时刻、加水倍数、提取时刻为首要影响要素，3味君药首要成分的含量和浸膏得率的归纳评分为目标，选用呼应面法优选银槐解毒颗粒最佳水提工艺。从试验数据的归纳剖析能够看出，加水倍数和提取时刻对该处方提取工艺有明显影响，且加水倍数的影响大于提取时刻；浸泡时刻对该处方提取工艺并无明显影响，考虑或许该处方中以花类药物为主，根茎类药材较少，故浸泡时刻对归纳评分无明显影响，与理论预期较为契合。在验证试验中发现，猜测值与实在值比较挨近，测定成果安稳，且3个成分的搬运率别离为绿原酸85.60%（处方中山楂和菊花也含有绿原酸[8]）、黄芩苷83.12%、芦丁73.32%，标明优选的最佳水提工艺对3种目标性成分提取效率高，能够成为中试出产的根据。
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（收稿日期：2017-06-13）
（修回日期：2017-07-17；修改：陈静）endprint