实验室质量操控 更年宁质量操控办法的树立研讨

石洪超　杨能英　何风雷

[摘要] 意图 树立点评更年宁质量的办法。办法 选用薄层辨别（TLC）的办法对更年宁中牡丹皮、白芍、丹参进行薄层定性辨别。选用高效液相色谱法（HPLC）测定更年宁中的特征性成分黄芩苷的含量。选用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，活动相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；检测波长为280 nm。成果 在TLC色谱图中能够检出牡丹皮、白芍、丹参的特征斑驳，且各斑驳明晰，易于调查。黄芩苷在92.4～924 ng范围内进样量与其峰面积线性关系杰出（r=0.9998）。均匀加样回收率为99.79%，RSD为1.33%（n=6）。该办法精细度、重复性和安稳性杰出。定论 本文树立的办法可供给更年宁的质量点评办法，该办法安稳、精确、无搅扰且简洁。

[关键词]质量操控；更年宁；薄层辨别；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.11 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（b）-0141-04

[Abstract]Objective To establish the method for the quality control of Gengnian Ning.Methods Moutan Cortex，Paeoniae Radix Alba，Salvia Miltiorrhiza of Gengnian Ning were identified by thin layer chromatography （TLC）.The content of baicalin （characteristic component of Gengnian Ning） was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）.The ZORBAX Eclipse XDB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm） was used，the mobile phase was methanol-water-phosphoric acid （47∶53∶0.2）and the detection wavelength was 280 nm.Results Moutan Cortex，Paeoniae Radix Alba，Salvia Miltiorrhiza could be detectable by TLC and the spots were clear for observation.In the range of 92.4-924 ng，baicalin showed a good linear relationship between sample size and its peak area （r=0.9998）.The average recovery was 99.79% with RSD=1.33% （n=6）.The method had good precision，stability and repeatability.Conclusion The established method is simple，accurate，reliable，reproducible and with strong specificity，which can be used for the quality control of Gengnian Ning.

[Key words]Quality control；Gengnian Ning；Thin layer chromatography；High performance liquid chromatography

更年宁由柴胡、黄芩、白芍、墨旱莲、人参、党参、郁金、香附（醋炙）、当归、薄荷、川芎、玄参、茯苓、法半夏、石菖蒲、牡丹皮、陈皮、干姜、白术（麸炒）、丹参、王不留行（炒）、女贞子（酒炙）等22味中药组成。更年宁处方源于《卫生部药品规范》中药成方制剂第六册（规范编号WS3-B-1138-92），成效为疏肝解郁，益气养血，健脾安神[1]。现履行的更年宁规范中只要显微辨别和墨旱莲的薄层辨别，无含量测定项目，内容简略，难以点评更年宁的内涵质量特性。本文经过实验研讨，发现白芍、牡丹皮、丹参的薄层色谱特征性强，斑驳明晰，能够列入质量规范，一起添加了高效液相色谱法（HPLC）测定黄芩中黄芩苷的含量测定，以期更好地操控更年宁的质量。

1 仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪型号为Waters 2695；检测器的型号为Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector；Sartorious（CP225D）十万分之一天平，Sartorious（BS110S）万分之一天平。SB-5200DT超声波清洗机（300 W，40 Hz）。色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：110736-201426）、丹参酮ⅡA对照品（批号：110766-200416）、黄芩苷对照品（供含量测定用，批号：110715-200212），来历均为我国药品生物制品檢定所。更年宁（10批水蜜丸）及阴性样品均由广州白云山陈李济药厂有限公司供给，乙腈为色谱纯；水为Millipore 去离子水；磷酸、乙醇、甲苯、乙酸乙酯和三氯甲烷等试剂均为AR。

2办法与成果

2.1丹参的薄层辨别实验

更年宁样品供试液的制备：取更年宁样品适量，粉碎成细粉，取约10 g， 加三氯甲烷70 ml，超声30 min，过滤，蒸干溶剂，用1.5 ml乙醇将残渣溶解，即得[2-3]。

丹参酮ⅡA对照品供试液的制备：取丹参酮ⅡA对照品约2.5 mg，置5 ml的容量瓶中，参加乙醇溶解，用乙醇稀释至刻度，即得。

丹参阴性对照溶液的制备：按更年宁的制备工艺，去掉丹参药材，制成缺丹参的阴性样品。取该样品适量，粉碎成细粉，按上述更年宁样品供试液的制备办法制备，即得。

检测办法：照薄层色谱办法实验，汲取更年宁样品供试液、丹参酮ⅡA对照品供试液、丹参阴性对照溶液各10 μl，别离点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯 （19∶1）为打开剂，打开，取出，晒干，日光下调查薄层色谱特征斑驳，见图1。

实验定论：更年宁样品色谱中，在与对照品丹参酮ⅡA色谱相对应的当地，都有暗红色的斑驳，斑驳明晰，在丹参阴性对照色谱中未见，因而丹参阴性对照无搅扰，能够列入质量规范。

2.2牡丹皮、白芍的薄层辨别实验

更年宁样品供试液的制备：取更年宁样品适量，粉碎成细粉，取约5.0 g，参加40 ml甲醇，超声提取40 min，过滤，蒸干溶剂，用5 ml甲醇将残渣溶解，即得[4]。

芍药苷对照品供试液的制备：取芍药苷对照品约5 mg，置5 ml的容量瓶中，参加乙醇溶解，用乙醇稀释至刻度，即得。

双阴性（牡丹皮、白芍） 供试液的制备：按更年宁的制备工艺，去掉牡丹皮、白芍2味药材，制成它们的双阴性样品。取该样品适量，粉碎成细粉，按上述更年宁样品供试液的制备办法制备，即得。

检测办法：照薄层色谱办法实验，汲取更年宁样品供试液、芍药苷對照品供试液、双阴性（牡丹皮、白芍） 供试液各3 μl，别离点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为打开剂，打开，取出，晒干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑驳显色明晰。见图2。

实验定论：更年宁样品色谱中，在与对照品芍药苷色谱相对应的当地，都有蓝色的斑驳，斑驳明晰，在双阴性（牡丹皮、白芍）色谱中未见。因而牡丹皮、白芍的双阴性无搅扰，能够列入质量规范，对本产品的质量操控有必定的含义。

2.3黄芩苷的含量测定办法及办法学调查

2.3.1 含量测定办法

更年宁样品供试液制备：取本品适量，粉碎成细粉，取约0.35 g，精细称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精细参加50 ml 70%乙醇，密塞，精细称定，超声提取（超声频率为40 kHz，超声功率为250 W）30 min，放冷，再次称定分量，以70%乙醇补足分量，用微孔滤膜过滤，取续滤液，即得[5]。

黄芩苷对照品溶液制备：精细称取黄芩苷对照品（60℃减压枯燥4 h）4 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升含黄芩苷40 μg的对照品溶液。

色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；活动相为甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；检测波长为280 nm；柱温为30℃；流速为1 ml/min；理论塔板数以黄芩苷峰计≥3000。

测定办法：别离精细汲取黄芩苷对照品溶液与更年宁样品供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3.2 办法学调查

2.3.2.1 专特点 按更年宁的制备工艺，去掉黄芩药材，制成黄芩的阴性样品。取该样品适量，粉碎成细粉，按“2.3.1”项下含量测定办法项下更年宁样品供试液制备办法制备黄芩阴性对照溶液，别离汲取黄芩苷对照品溶液、更年宁样品供试液、黄芩阴性对照溶液各10 μl，依法测定。更年宁样品色谱图中，在与黄芩苷对照品色谱相对应的方位上，有相同保存时刻的色谱峰，而黄芩阴性对照品色谱无搅扰，标明本法有专特点，能够作为含量测定目标，见图3。

2.3.2.2 线性关系调查 别离精细汲取黄芩苷对照品母液（0.0924 mg/ml）1、2、4、6、8、10 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成浓度为9.24、18.48、36.96、55.44、73.92、92.4 ng/μl的对照品溶液，别离汲取10 μl注入液相色谱仪，平跋涉样各两次，以两次峰面积均匀值为纵坐标、黄芩苷进样量（ng）为横坐标，制作黄芩苷规范曲线，其线性回归方程为：Y=3442.8X-35 951（r=0.9998）。成果标明黄芩苷进样量在92.4～924 ng范围内，峰面积与进样量之间的线性关系杰出。

2.3.2.3 精细度实验 取同一批更年宁样品（批号：2014 1001），按“2.3.1”项下含量测定办法项下更年宁样品供试液制备办法制备供试液，顺次进样6次，依法测定。经测定供试液中的黄芩苷色谱峰面积的规范偏差（RSD）为0.31%，显现该液相色谱具杰出的精细度。

2.3.2.4 重复性实验 取更年宁样品（批号：20141001）6份，每份精细称取0.35 g，按“2.3.1”项下含量测定办法项下更年宁样品供试液制备办法制备供试液，依法测定，黄芩苷的含量为3.91 mg/g，RSD为0.22%（n=6），成果显现该办法重复性杰出。

2.3.2.5 安稳性 取更年宁样品（批号：20141001），按“2.3.1”项下含量测定办法项下更年宁样品供试液制备办法制备供试液，顺次在0、2、4、6、8、12 h进样，依法测定，测得黄芩苷的均匀峰面积为875481.5，RSD为0.25%（n=6）。成果显现供试液在12 h内具有杰出的安稳性。

2.3.2.6 精确度（回收率实验） 取更年宁样品（批号：20141001）6份，每份约0.18 g，精细称定，顺次别离每份添加黄芩苷对照品溶液（0.3776 mg/ml）2 ml，按“2.3.1”项下含量测定办法项下更年宁样品供试液制备办法制备供试液，依法测定，依测得数据核算样品回收率，成果见表1。黄芩苷的均匀回收率为99.79%，RSD为1.33%（n=6）。

2.3.2.7 样品含量测定 取更年宁样品10批，按“2.3.1”项下含量测定办法项下更年宁样品供试液制备办法制备供试液，依法测定，按测得数据核算供试液中的黄芩苷含量，成果见表2。

3评论

在薄层辨别实验中，白芍的薄层辨别特征斑驳主要是芍药苷，对处方中白芍的薄层辨别进行研讨，发现样品中阴性有搅扰，经查阅文献资料，处方中白芍和牡丹皮均含有芍药苷，因而，树立了白芍和牡丹皮双阴性的薄层辨别办法；对处方中的川芎、当归的薄层辨别进行了研讨，别离对川芎、当归的薄层做了比较实验，川芎和当归的单阴性样品有搅扰，考虑到川芎和当归自身色谱特征很类似，常常作为双阴性的方式呈现，一起调查了缺川芎和当归两味药材双阴性的搅扰状况，进一步实验发现更年宁中当归、川芎的双阴性也有搅扰[6]；对处方中玄参、干姜、白术、香附、王不留行、郁金和陈皮的薄层辨别进行了研讨，但样品和阴性的色谱特征斑驳类似度很高，根本没有差异，标明阴性对照实验有搅扰[7-13]；对处方中人参、薄荷、石菖蒲、党参、柴胡和法半夏的薄层辨别进行了研讨，但样品和对照药材的色谱斑驳色彩有差异，且Rf值也有偏移，或许因为该处方成分杂乱，其它成分搅扰影响其斑驳的显色和成分的打开[14-19]。

在含量测定研讨中，本品处方由22味中药组成，白芍中有用活性成分芍药苷、牡丹皮中有用活性成分丹皮酚，但芍藥苷和丹皮酚的阴性有搅扰，专特点欠好，因而，正文中挑选了黄芩作为含量测定目标，以其有用活性成分黄芩苷作为目标成分，树立了黄芩苷的含量测定（高效液相色谱法）。剖析办法验证成果标明该测定办法专属、成果精确、重复性好。对样品的提取办法进行了调查，超声提取45 min和回流提取3 h的提取功率挨近，考虑到操作的简略、便利，挑选超声提取。在此基础上，对超声时刻（30、45、60 min）进行了比较，超声30 min后，样品溶液中的黄芩苷的含量不再添加，阐明30 min超声现已彻底，故断定样品的超声时刻为30 min。

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（收稿日期：2017-06-28 本文修改：许俊琴）