调Q技能 根据UPLC—Q—TOF—MS技能的芩百清肺浓缩丸血清药物化学开始研讨
刘烨+魏文峰+霍金海+王伟明
[摘要]使用UPLC-Q-TOF-MS技能和血清药物化学理论剖析检测芩百清肺浓缩丸的入血成分。灌胃给予大鼠芩百清肺浓缩丸溶液后，肝门静脉采血，血清经SPE处理，选用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），0.1%甲酸水（A） -0.1%甲酸乙腈（B）活动相体系进行梯度洗脱，流速0.3 mL·min-1，柱温35 ℃。经过比照剖析体外样品、空白血清及含药血清，一起结合Peakview和Metabolitepilot软件判定和表征其血中移行成分，在给药后的大鼠血清中剖析判定了28个血中移行成分，其间18个原型成分，10个代谢产品。使用UPLC-Q-TOF-MS技能和血清药物化学理论较为全面地阐明晰芩百清肺浓缩丸在大鼠血清中的移行成分，为进一步研讨其体内代谢进程以及药效物质根底供给了科学依据。
[要害词]芩百清肺浓缩丸； 血清药物化学； 血中移行成分； UPLC-Q-TOF-MS
[Abstract]To analyze the main components of Qinbai Qingfei concentrated pellets in rat serum with UPLC-Q-TOF-MS technology and serum pharmacochemistry theory. After gavage administration with Qinbai Qingfei concentrated pellets， blood was collected from hepatic portal vein. ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was used， with 0.1% formic acid agueous solution（A）-0.1%formic acid and acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.3 mL·min-1， the column temperature was maintained at 35 ℃. Through the comparative analysis fingerprints of Qinbai Qingfei concentrated pellets， drug containing-serum and blank serum， and with the help Peakview and Metabolitepilot software， components in serum were defined. A total of 28 compounds were identified， including 18 prototypes and 10 metabolites. As a result， UPLC-Q-TOF-MS technology and serum pharmacochemistry theory were applied to comprehensively expound Qinbai Qingfei concentrated pellets′constituents migrating to rat serum， and provide scientific basis for further studies for in vivo metabolic process and effective material base.
[Key words]Qinbai Qingfei concentrated pellets； serum pharmacochemistry； constituents migrating to serum； UPLC-Q-TOF-MS
中藥血清药物化学是以传统药物化学办法为根底，归纳使用多种现代技能，剖析判定口服中药后血清中移行成分，研讨其与药效相关性，断定中药药效物质根底的使用学科[1]。此办法自提出以来现已被成功使用于多种中药以及中药复方的研讨[2-3]，研讨成果不只提醒中药药效物质根底，而且为解析丹方配伍规则、阐释中药药理学特性及立异药物规划等中医药要害科学问题供给了科学有用的办法。
芩百清肺浓缩丸（以下简称芩百，发明专利证书号ZL03102049.6），是国家食品药品监督管理总局同意的第一个用于临床调查医治小儿支原体肺炎的中药制剂，由黄芩、百部、紫菀、桔梗、麦冬、地龙6味中药组成，具有清热解毒、降气平喘、润肺止咳之成效，适用于儿童支原体肺炎的医治。前期试验标明，其能进步免疫功用和促进气道上皮细胞的修正，能有用减轻支原体对肺部安排的炎性病变，促进上皮细胞的康复[4-6]。可是芩百的药效物质根底没有彻底阐明，本文使用血清药物化学办法以及UPLC-Q-TOF-MS技能进一步研讨芩百的血中移行成分，旨在提醒其药效物质根底。
1 资料
Waters ACQUITYTM UPLC液相色谱仪（Waters，USA）；AB Sciex 5600+型质谱仪（Sciex，USA）；Analyst TF 1.6工作站（Sciex，USA）；PeakView 2.0软件（Sciex，USA）；Metabolitepilot 1.5 软件（Sciex，USA）；IKA MS3 digital涡旋振荡器（广州仪科试验室技能有限公司，我国）；MTN-2800W氮吹浓缩设备（天津奥特赛恩斯仪器有限公司，我国）；RAININ E4 XLS主动单道移液器[标准：0.1～1 mL，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，我国]；SBP100-200手动单道移液器[标准：20～200 μL，赛比奥科技（广州）有限公司，我国]； AccuBOND ODS-C18固相萃取小柱（标准100 g· L-1，Agilent，USA）。
芩百清肺浓缩丸（黑龙江中医药科学院制剂室供给，批号20150401，标准3 g/袋）；黄芩（Scutellariae Radix，批号20141201，产地内蒙古）；蜜百部（Stemonae Radix，批号20141101，产地东北）；蜜紫菀（Asteris Radix et Rhizoma，批号20141201，产地河北）；桔梗（Platycodonis Radix，批号20141201，产地河北）；麦冬（Ophiopogonis Radix，批号20141201，产地四川）；地龙（Pheretima，批号20141201，产地河北），一切饮片购自北京同仁堂哈尔滨药店，各药材均由黑龙江省中医药科学院王伟明研讨员判定为正品。甲醇和乙腈（色谱级，Merck公司）；甲酸（色谱级，Fisher公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。
健康SD雄性大鼠，体重（300±20） g，SPF级，许可证号SCXK（京）2012-0001，由北京维通利华试验动物技能有限公司供给。
2 办法
2.1 芩百水煎液以及冻干粉制备
取单味药适量，按芩百清肺浓缩丸制备工艺提取，制成冻干粉。
2.2 供试品溶液制备
取芩百清肺浓缩丸冻干粉末1 g（过40目筛），精细称定，参加30 mL 75%甲醇，超声30 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得。
2.3 体内剖析样品的制备
取SD大鼠，禁食12 h（自在饮水），给药组依照23.085 g·kg-1灌胃给予芩百冻干粉灌胃液，空白组依照20 mL·kg-1灌胃给予蒸馏水。给药1 h后，腹腔打针10%水合氯醛进行麻醉，肝门静脉取血，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，-80 ℃冻存备用。
取大鼠空白血清及给药血清各400 μL，各加10 μL磷酸，涡旋震动60 s，别离上样到预先以2 mL甲醇、2 mL水活化平衡的SPE柱上，以2 mL水淋洗，淋洗液弃去，再以2 mL甲醇洗脱，搜集洗脱液，氮气吹干，残渣用200 μL甲醇复溶，涡旋震动60 s后，4 ℃，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，进样2 μL供UPLC-Q-TOF-MS剖析。
2.4 剖析条件
2.4.1 质谱条件 离子化形式为电喷雾正、负离子形式，正负离子源电压别离为5 500，-4 500 V，离子源温度为550 ℃，雾化气体为N2，雾化气（Gas1）为55 psi（1 psi=6.895 kPa），辅佐气（Gas2）为55 psi，气帘气（curtain gas）为35 psi，裂解电压（DP）别离为80，-80 V，磕碰能量（CE）别离为35，-35 eV，磕碰能量扩展（CES）均为15 eV。TOF-MS扫描规模为100～1 500，IDA设置响应值超越100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，Product Ion扫描规模为50～1 500，敞开动态布景扣除（DBS）。数据收集所用软件为Analyst TF 1.6 software，数据处理软件为Peakview 2.0/Masterview 1.0 software。
2.4.2 色谱条件 Waters ACQUITYTM UPLC液相色谱仪；ACQUITYTM BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；预柱ACQUITYTM UPLC BEH C18维护柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；柱温35 ℃；活动相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，0～4 min，95%～73%A，4～5 min，73%A，5～10 min，73%～50%A，10～13 min，50%～30% A，13～14 min，30%A，14～20 min，30%～0%A，流速0.3 mL·min-1；样品仓温度4 ℃；进样量2 μL；色谱仪流出液不分流直接进行正负离子扫描检测。
2.5 数据剖析办法
使用Peakview软件经过比照给药后血清和空白血清的质谱图，扣除血清中的内源性成分，将剩下离子峰与体外药材提取液离子峰的保存时刻，质荷等到二级质谱图进行比照，假如一起则确以为芩百清肺浓缩丸中的原型成分；使用MetabolitePilot数据处理软件，将空白血清及给药血清样品导入，树立Compound library，设置Biotransformation parameters，挑选Ⅰ和Ⅱ相代谢途径，依据软件数据成果和参阅文献资料估测其代谢产品。
3 成果
3.1 UPLC-Q-TOF-MS色谱图的收集
依据树立的芩百血中移行成分剖析办法，在正、负离子形式下收集以上样品的色谱图，见图1。
3.2 血中移行成分判定
本课题组前期现已使用UPLC-Q-TOF-MS技能对芩百的化学成分进行了剖析，在剖析进程中依据精确相对分子质量、同位素丰度比、分子碎片峰，参阅相关文献、对照品色谱保存时刻及二级谱图，共揣度了78个化合物，其间14个来自黄芩，29个来自百部，10个来自麦冬，13個来自紫菀，3个来自桔梗，9个来自地龙[7]。本试验在此根底上依据2.5项下办法，结合以往文献报导[8-14]，判定了大鼠口服芩百后的28个血中移行成分，其间18个为原型成分，10个为代谢产品，并对其来历进行了归属，成果见表1。
3.3 首要色谱峰的质谱剖析
3.3.1 原型成分 试验共判定和表征出18个原型成分，别离以化合物3，13为例阐明估测进程。化合物3：正离子形式下，其在含药血清总离子图与芩百样品总离子流图中金刚大碱的保存时刻根本一起[7]，二级质谱碎片一起，准分子离子峰m/z 322[M+H]+相对丰度较强，具有一起二级碎片m/z 248，230，174等，故估测其结构为金刚大碱，二级质谱图见图2，或许的裂解途径见图3。
化合物13：正离子形式下，其与芩百样品总离子流图中亚油酸的保存时刻根本一起，二级质谱碎片一起，准分子离子峰m/z 281[M+H]+相对丰度较弱，具有一起二级碎片m/z 263，245，133等，故推測其结构为亚油酸，二级质谱图见图4，或许的裂解途径见图5。
3.3.2 代谢产品 依据2.5项下办法结合MetabolitePilot代谢物数据处理软件给出的代谢物最优化峰匹配，终究估测10个代谢产品，以黄芩苷甲基化产品和甲基麦冬黄烷酮B氧化产品为例阐明判定进程。
黄芩中黄芩苷的代谢较为简略[15]，其7位上葡萄糖醛酸基可脱去，也可从头结合至6位或7位，因此在体内代谢时刻较长，别的 B环的苯环性质也比较生动，可发作甲基化、羟基化等Ⅰ相反响。代谢物正离子形式下，准分子离子峰m/z 461[M+H]+，比黄芩苷准分子离子峰m/z 447[M+H]+多14，提示添加1个CH2，发作甲基化，结合其特征碎片m/z 385，270，与黄芩苷二级碎片比较，契合其甲基化进程，结合文献报导黄芩苷甲基化产品代谢位点或许在B环的4号位。代谢产品匹配度见图6，或许的裂解途径见图7。
麦冬中的高异黄酮是黄酮中特别的一类，其母体结构仅比异黄酮多1个碳原子。可是其裂解办法与黄酮有显着差异。麦冬中黄酮类化合物B环改变发作的代谢产品较多[16-17]，尤其是B环有羟基替代的化合物，代谢位点多发作在B环上。
代谢物在负离子形式下，准分子离子峰m/z 343[M-H]-，比甲基麦冬黄烷酮B准分子离子峰m/z 327 [M-H]-多16，提示添加1个O，发作氧化反响，结合碎片m/z 175，167，152，137等，与甲基麦冬黄烷酮B二级碎片比较，契合其氧化进程，结合文献报导甲基麦冬黄烷酮B氧化产品代谢位点或许在B环的3号位。代谢产品匹配度见图8，或许的裂解途径见图9。
4 评论
试验中在灌胃给予大鼠芩百后，别离在15，30 min，1，2，4，8 h于肝门静脉采血。经过对含药血清色谱图峰强度、峰数目及共有入血成分的峰含量比照剖析，断定给药后1 h为最佳采血时刻点。血清处理时调查了有机溶剂堆积（甲醇，乙腈）以及固相萃取（SPE）等多种办法，成果有机溶剂堆积后样品色谱图的布景较高，而SPE办法处理后的色谱图布景较低，故选用SPE办法处理。试验中血清处理时还调查了是否加磷酸，成果标明血清处理参加10 μL磷酸后，所得到的移行成分更多，且响应值有显着进步。
本试验并没有检测到来自桔梗的入血成分，或许是因为现在文献中报导的桔梗成分大多数为皂苷类成分，其结构不稳定，易发作源内裂解，测定该类化合物时需求的DP及CE较其他类成分低，为了检测到其他大部分化合物，DP设为80，-80 V，CE设为35，-35 eV，CES设为15 eV。估测这或许是桔梗类成分检测不到的重要因素，需要展开针对桔梗类成分的深入研讨。
在大鼠灌胃芩百溶液后的含药血清中共判定出18个原型成分，其间来自百部的多为生物碱类成分，生物碱具有镇咳平喘的效果，能延伸小鼠浓氨水引咳的潜伏期，削减咳嗽次数，添加大鼠毛细管排痰量，尤其是叶百部碱，它对豚鼠腹腔给药枸橼酸后引起的咳嗽具有剂量依赖性按捺效果[18]。黄芩的首要成分是黄酮及其苷类，其具有解热抗炎，抗微生物的药理效果。其间黄芩苷和黄芩素可以经过搅扰花生四烯酸的代谢通路、按捺细胞因子的活性等发作解热抗炎效果[19]。黄芩苷更是有直接诱杀支原体的效果，其对支原体的MIC为0.97～3.90 g·L-1[20]。地龙有止咳平喘的效果，研讨标明，地龙能明显削弱哮喘小鼠炎性反响，尤其能按捺嗜酸性粒细胞的添加和滋润，并可按捺或反转胶原蛋白堆积以及气道黏液的高排泄，然后减缓或按捺哮喘气道重组的进程，并可改进哮喘小鼠的日子质量及生计状况，到达医治哮喘的意图[21]。而不饱和脂肪酸类成分等更是具有调理免疫体系，增强免疫功用的效果。结合各味药药理活性相关报导和传统成效，开始揣度入血的28种成分或许为其体内发挥效果的药效物质根底，有待进一步研讨。
本试验使用UPLC-Q-TOF-MS技能经过比较剖析芩百体外提取液与扣除空白血清内源性成分后的含药血清，开始估测出28个入血成分，包含18个原型成分，10个代谢产品。成果标明该办法简洁、精确，为芩百药效物质根底的进一步研讨奠定了根底。
[参阅文献]
[1]王喜军.中药及中药复方的血清药物化学研讨[J]. 国际科学技能——中医药现代化， 2002， 4（2）：1.
[2]王喜军，张宁，曹洪欣，等.复方安替威胶囊大鼠血清药物化学的开始研讨[J].我国中药杂志，2006，31（18）：1538.
[3]唐锋，梁少瑜，陈飞龙，等.血清药物化学和血清药理学相结合的办法讨论麻黄附子细辛汤抗炎和免疫按捺的物质根底[J].我国中药杂志，2015，40（10）：1971.
[4]李继昌，董龙，杨阳，等.芩百清肺浓缩丸对支原体肺炎模型鼠肺安排影响的研讨[J].我国防备兽医学报，2004，26（3）：222.
[5]王伟明，张洪娟，唐慧兰.芩百清肺浓缩丸首要药效学研讨[J].黑龙江中药，2003（6）：42.
[6]Cheng H Y，Chen J H，Yang H H，et al. Identification of active components in Styela clava by HPLC-ESI-TOF/MS and the study on their HPLC specific chromatograms[J].Acta Pharm Sin，2010，45（10）：1285.
[7]褚衍濤，魏文峰，霍金海，等.UPLC-Q-TOF-MS剖析芩百清肺浓缩丸中的化学成分[J].中成药，2016， 38（6）：1303.
[8]魏玲，周茂金，张铁军.咖啡酸在大鼠体内两个葡萄糖醛酸结合物的别离与判定[J].中草药，2010，41（6）：949.
[9]Matsui Y， Nakamura S， Kondou N， et al. Liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry for simultaneous analysis of chlorogenic acids and their metabolites in human plasma[J]. J Chromatogr B，2007， 858 （1/2）：96.
[10]谢岑，钟大放，陈笑艳.判定大鼠打针绿原酸后体内的代谢产品[J].药学学报，2011，46（1）：88.
[11]李哲，宋瑞，许风国，等.大鼠灌服枳实提取液后体内黄酮类代谢产品的LC-MS-MS剖析[J].我国药科大学学报，2010，41（6）：539.
[12]邢萌萌，朱科学，聂少平.UPLC-Q-TOF-MS检测槲皮素代谢产品在大鼠血清及安排中的散布[J].食品科学，2013，34（24）：158.
[13]符乃光，陈峰，魏娜.LC-MS法判定槲皮素在大鼠体内的首要代谢产品[J].药物剖析杂志，2009，29（5）：764.
[14]金慧.葛根芩连汤血清药化学研讨[D].上海：上海交通大学，2008.
[15]孙亮.痰热清打针液体内代谢与相互效果研讨[D].上海：第二军医大学，2013.
[16]吴茵.根据液质联用技能的麦冬化学成分剖析与药代动力学研讨[D].石家庄：河北医科大学，2015.
[17]Chen Z W， Ling T， Li S M， et al. Identification of metabolites of Radix Paeoniae Alba extract in rat bile， plasma and urine by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry [J]. J Pharm Anal，2014， 4（1）：14.
[18]Zhou X， Leung P H H， Li N， et al. Oral absorption and antitussive activity of tuberostemonine alkaloids from the roots of Stemona tuberosa[J]. Planta Med，2009， 75（6）：575.
[19]Tsai C C， Lin M T， Wang J J，et al. The antipyretic effects of baicalin in lipopoly saccharide-evoked fever in rabbits[J]. Neuropharmacology， 2006，51（4）：709.
[20]孙艳平，董秀华.黄芩苷体外诱导肺炎支原体耐药的试验研讨[J].中医药信息，2010，27（4）：115.
[21]唐秋凤.地龙对哮喘小鼠气道重组的效果研讨[D].广州：广东药学院，2014.
[责任编辑 曹阳阳]