血清里边有没有DNA 国产PCR试剂和COBAS体系血清HBV—DNA检测成果不一致的原因剖析
姜新华++高国生++胡爱荣
[摘要] 意图 探討国产PCR试剂和COBAS体系血清HBV-DNA检测成果不共同的原因。 办法 搜集2013年12月～2015年10月来本院肝病中心就诊的缓慢HBV感染者230例，国产PCR试剂血清HBV-DNA成果均为阴性，运用COBAS体系予以复查，剖析两种办法HBV-DNA检测成果的差异及或许的影响要素。 成果 106例（46.09%）患者两种办法血清HBV-DNA检测成果均低于检测下限；124例（53.91%）患者在COBAS体系可检测到不同载量的HBV-DNA，包含3例（1.30%）隐匿性HBV感染。跟着患者血清HBV-DNA载量的添加，性别比、HBeAg效价和阳性率、血常规和凝血功用等目标差异均无统计学含义（P>0.05），但血清HBsAg效价、终晚期肝病构成比、肝功用酶类目标、AFP等逐步升高（P<0.05）。血清HBV-DNA与HBsAg效价、肝功用目标、AFP均有必定相关性（P<0.05），与HBeAg效价无相关性（P=0.87）。 定论 针对肝功用目标反常、HBsAg效价较高、病况较重（特别是终晚期肝病）的缓慢HBV感染患者，国产PCR试剂检测血清HBV-DNA阴性时有必要运用COBAS体系复查。
[关键词] 乙型肝炎病毒；脱氧核糖核酸；终晚期肝病；COBAS Taqman体系；荧光定量PCR
[中图分类号] R512.6 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）02-0000-03
Analysis of the causes of inconsistency of serum HBV-DNA test results between homemade PCR reagent and COBAS system
JIANG Xinhua1 GAO Guosheng2 HU Airong3
1.Clinical Laboratory， Quhua Hospital in Zhejiang Province， Quzhou 324004， China； 2.Clinical Laboratory， Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， China； 3.Department of Liver Diseases， Ningbo Second Hospital， Ningbo 315010， China
[Abstract] Objective To explore the causes of inconsistency of serum HBV-DNA test results between homemade PCR reagent and COBAS system. Methods A total of 230 patients with chronic HBV infection who were diagnosed in the Center for Liver Diseases in our hospital from December 2013 to October 2015 were collected. The serum HBV-DNA results of homemade PCR reagents were all negative. COBAS system was applied for retest. The differences of HBV-DNA test results by both methods and the possible influencing factors were analyzed. Results The test results of serum HBV-DNA in 106 cases （46.09%） were lower than the lower limit of detection in both methods， HBV-DNA with different capacity was detected in the COBAS system in 124 patients（53.91%）， including 3 cases（1.30%） of occult HBV infection. With the increase of patients' serum HBV-DNA capacity， there was no significant difference in sex ratio， HBeAg valence and positive rate， blood routine test and coagulation function（P>0.05）. But serum HBsAg valence， end-stage liver disease ratio， liver function enzyme index， and AFP were gradually increased（P<0.05）. Serum HBV-DNA was associated with HBsAg valence， liver function index and AFP （P<0.05）， yet was not associated with HBeAg valence（P=0.87）. Conclusion In patients with chronic HBV infection who have abnormal liver function， high HBsAg valence， and severe illness（especially end-stage liver disease）， negative results of serum HBV-DNA tested by homemade PCR reagents need to be re-tested by COBAS system.
[Key words] Hepatitis B； DNA； End-stage liver disease； COBAS Taqman System； Fluorescent quantitative PCR
缓慢 HBV 感染是导致我国终晚期肝病的首要病因[1]，HBV-DNA 定量测定能精确地反映病毒仿制程度[2]，对慢乙肝相关疾病的医治、监测及预后的点评均十分重要[3]。近年来国产 HBV-DNA 检测试剂因为选用了牢靠的质量办理体系，一起卫计委要求PCR试验室均选用评定准入准则，国产PCR试剂用于慢乙肝患者血清HBV-DNA的检测根本能够满意临床需求[4]。但因为与世界参阅办法（COBAS体系）在样本用量、内标、引物等方面存在差异[5]，导致灵敏度和精确性稍有短缺。本文运用COBAS体系对230例国产PCR试剂血清HBV-DNA检测成果阴性的患者予以复查，剖析两者成果不共同的或许原因，并为检测办法的合理运用供给根据。
1 材料与办法
1.1 一般材料
本研讨230例患者均为2013年12月～2015年10月来本院肝病中心就诊的缓慢HBV感染者，一切患者的确诊标准均契合《缓慢乙型肝炎防治攻略》（2015版）[6]，HBsAg和（或）HBV-DNA阳性6个月以上，在外其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、药物性肝病、本身免疫性肝病者。其中男167例，女63例，年纪17～81岁，均匀（55.67±12.74）岁，将一切患者按血清HBV-DNA水平（COBAS体系）凹凸分为三组，A组106例（<20.00 IU/mL），B组100例（20.00～1.00×103 IU/mL），C组24例（>1.00×103 IU/mL），三组的年纪和性别份额均无显着差异，具有可比性。
1.2 检测办法及调查目标
一切患者初次血清HBV-DNA检测均选用国产 PCR 试剂，仪器为美国 ABI 7500 型荧光定量 PCR 仪。检测成果当日报答给临床医师，当置疑与临床实践不相符时，当日或次日再次采血用 Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48 体系及配套试剂（简称COBAS体系）复查 HBV-DNA。一起检测患者 HBV 血清标志物、肝功用、血常规、凝血功用和甲胎蛋白（AFP）等或许影响血清HBV-DNA的目标，HBsAg和HBeAg效价选用ABBOTT雅培AXSYM i2000全自动免疫剖析仪及配套试剂，肝功用检测选用 Siemens ADVIA2400 全自动生化剖析仪及配套装试剂，血常规检测选用 Sysmex i2000全自动血液剖析仪和配套试剂，凝血功用检测选用 ACL TOP 全自动凝血剖析仪和配套试剂，甲胎蛋白检测选用Siemens ADVIA Centaur XP全自动免疫剖析仪和配套试剂。
1.3 统计学办法
选用SPSS 16.0 软件，正态散布的计量材料以均数±标准差（x±s）表明，多组均数比较选用方差剖析；偏态散布的计量材料选用中位数（四分位数）表明，多组均数比较选用非参数查验；计数材料选用例数和率表明，率的比较选用χ2查验。选用Spearman相关剖析各目标之间的相关性。P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 根本状况
230例患者经COBAS体系复查后，106例（46.09%）仍低于检测下限，124例（53.91%）能够检测到HBV-DNA（从20.93 IU/mL～大于1.70×108 IU/mL不等），特别是有24例患者高于1.00×103 IU/mL，并发现3例（1.30%）隐匿性HBV感染（HBsAg均为阴性，血清HBV-DNA分别为37.10 IU/mL、154.00 IU/mL、163.00 IU/mL）。
2.2 不同血清HBV-DNA水平患者的试验室目标比较
将一切患者按血清HBV-DNA水平（COBAS体系）凹凸分为三组，A组：<20.00 IU/mL，B組：20.00～1.00×103 IU/mL，C组：>1.00×103 IU/mL，跟着血清HBV-DNA的添加，患者的年纪、性别份额、HBeAg效价和阳性率、TBil、血常规和凝血功用目标差异均无统计学含义（P>0.05），但血清HBsAg效价、终晚期肝病构成比、DBil、TP、肝功用酶类目标（包含ALT、AST、ALP、GGT等）、AFP逐步升高（P<0.05），而A组患者的ALB水平显着高于B、C组（P<0.05）。见表1。
2.3 血清HBV-DNA与其他目标的相关性
Spearman相关剖析显现，血清HBV-DNA与HBsAg效价、肝功用目标、AFP均有必定相关性（P<0.05）；而与HBeAg效价无相关性，相联系数r为0.011（P=0.87）。见表2。
3 评论
监测血清HBV-DNA的改变，关于判别缓慢 HBV 感染患者抗病毒医治的作用及预后十分重要。现在国内血清 HBV-DNA 水平的检测多选用国产试剂盒，但各厂家的办法没有标准化，且受标本状况、退火温度以及样品中酶活性按捺物等多种要素的影响，各种检测办法的灵敏度、精密度、检测规模等方面均存在差异[7]。COMBAS 体系作为世界参阅办法，选用磁珠法提取 DNA、引物探针掩盖高变区、建立内参照，故具有高灵敏度、精确度和线性规模等长处[8]，但也有耗时长、费用贵重等不适宜大规模推行运用的缺点。在临床实践中，部分患者选用国产PCR试剂的血清 HBV-DNA 检测成果低于检测下限，但仍有活动性肝病的症状或通过标准的抗病毒医治考虑停药，此刻有必要清晰患者的病毒实践仿制状况。
本文归入的230例患者经COBAS体系复查后，发现超越一半的病例能够检测到HBV-DNA，并且还有24例高于国产PCR试剂的检测下限（1.00×103 IU/mL），后者或许是国产PCR试剂存在检测盲区导致的假阴性[9]，而COBAS体系因为选用了包含高变区的多对引物具有更好的检测才能；而适当份额的患者存在乙肝病毒低仿制状况，提示部分患者通过标准的抗病毒医治后，即便HBV血清标志物（特别是HBeAg）、ALT水平得到显着操控后，仍不能随意停药。并且极少数患者尽管乙肝表面抗原阴性，在血清中仍可检测到低仿制的乙肝病毒，这种隐匿性HBV感染状况为不明原因肝病的病因确诊供给了根据。
为剖析哪些患者简单呈现国产PCR试剂检测阴性而COBAS体系阳性，本研讨将一切患者按血清HBV-DNA水平凹凸分组，成果发现跟着血清HBV-DNA的添加，血清HBsAg效价、血清肝功用目标（包含ALT、AST等）、终晚期肝病比率逐步升高，但HBeAg的效价和阳性率均无显着差异（并且大部分患者血清HBeAg效价较低而表现为HBeAg阴性状况）；Spearman相关剖析也提示血清HBV-DNA与HBsAg、ALT相关，而与HBeAg效价无相关性。一般以为，HBeAg阳性是HBV仿制活泼、传染性强的标志，但部分患者因为前C区和/或根本中心发动子基因的变异导致e抗原排泄削减或不表达，但HBV仍不同程度仿制，故此刻HBeAg不能作为点评抗病毒效果以及传染性强弱的根据，这与既往研讨定论共同[10-12]。关于血清HBV-DNA与HBsAg效价的相关性现在存在争议[13-16]，这或许与各研讨归入病例的异质性有关，正常状况下，X蛋白是乙肝病毒DNA仿制过程中必需的功用蛋白[17]，在促进HBV-DNA仿制的一起，按捺S抗原表达，导致两者负相关，但一旦病毒发作变异HBsAg效价的改变趋势或许与HBV-DNA共同，本文也是如上观念。HBV前C区变异与缓慢HBV感染者向终晚期肝病开展亲近有关[18-20]，本文的观念与之共同。
总归，因为国产PCR试剂在灵敏性、精确性方面上存在缺点，关于那些ALT水平反常、HBsAg效价较高、病况较重（特别是终晚期肝病）的缓慢HBV感染患者，国产PCR试剂检测血清HBV-DNA阴性仍有必要考虑HBV-DNA处于仿制状况，此刻COBAS体系不失为一个抱负的挑选。
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（收稿日期：2016-06-01）