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儿童长时间服用左卡尼汀 高效液相色谱法测定左卡尼汀注射液的含量及杂质A

点击:0时间:2022-12-05 23:47:44

袁彩君+++朱天新

[摘要] 意图 树立一种以阴离子色谱柱为别离介质测定左卡尼汀打针液含量及杂质A的高效液相色谱法。 办法 色谱柱为PhenoSphere 5u SAX 80A(250 mm×4.60 mm),柱温30℃;活动相为乙腈∶磷酸盐溶液(磷酸二氢钾6.81 g/L,以氢氧化钠溶液调理pH为4.7)=65∶35;检测波长为205 nm,进样量20 μl;流速1.0 ml/min,外标法核算。 成果 左卡尼汀和杂质A得到有用别离,别离度>1.5,辅料及活动相不搅扰测定;左卡尼汀的检出限和定量限别离为0.5、2 μg/ml,左卡尼汀杂质A的检出限、定量限别离为20、50 ng/ml;左卡尼汀在1034~8274 μg/ml范围内线性关系杰出(r2=0.99996),杂质A在0.25~25 μg/ml范围内线性关系杰出(r2=0.99987);左卡尼汀和杂质A均匀收回率别离为101.29%(RSD=0.55%)、100.35%(RSD=1.79%)。 定论 该办法专属、精确、简洁,可用于左卡尼汀打针液的含量和杂质A测定。

[关键词] 左卡尼汀打针液;左卡尼汀;杂质A;高效液相色谱法;测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2015)07(a)-0008-06

Content and impurity A of levocarnitine injection determined by high performance liquid chromatography

YUAN Cai-jun1 ZHU Tian-xin2

1.Department of Pharmacy,Zhumadian Central Hospital in Henan Province,Zhumadian 463000,China;2.Xintai Pharmaceutical Co., LTD. of Henan Province,Zhumadian 463000,China

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method determining the content and impurity A of levocarnitine injection selecting anion chromatographic column as separation medium. Methods The column was PhenoSphere 5u SAX 80A (250×4.60 mm) and the column temperature was 30 ℃.The mobile phase was the ratio of acetonitrile and phosphate solution (potassium dihydrogen phosphate of 6.81 g/L regulated by sodium hydroxide solution with the pH of 4.7) was 65:35.The detection wavelength was 205 nm and injection volume was 20 μl.The flow velocity was 1.0 ml/min and the outcome were calculated by external standard method. Results Levocarnitine and impurity A was effectively separated,and the degree of separation was over 1.5.Determination was not interfered by adjuvant material or mobile phase.The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of levocarnitine was 0.5 μg/ml and 2 μg/ml respectively.The LOD and LOQ of impurity A in levocarnitine was 20 ng/ml and 50 ng/ml respectively.Ranging from 1034 to 8274 μg/ml,levocarnitine displayed a good linear relationship (r2=0.99996).Ranging from 0.25 to 25 μg/ml,impurity A displayed a good linear relationship (r2=0.99987).The average recovery rate of levocarnitine and impurity A was 101.29% (RSD=0.55%) and 100.35% (RSD=1.79%). Conclusion The established method is specific,accurate and convenient,which can be used for the determination of content and impurity A in levocarnitine injection.

[Key words] Levocarnitine injection;Levocarnitine;Impurity A;High performance liquid chromatography;Determination

左卡尼汀(levocarnitine,LC)又称左旋肉毒碱,其首要功用是将长链脂肪酸运至线粒体进行β-氧化,并发生能量;它还能加快乙酰乙酸的氧化,在酮体代谢中起到积极效果。LC参加异亮氨酸和亮氨酸等代谢产品的转运,有益于氨基酸的正常代谢,并参加精子的老练进程;其对脂溶性维生素A、E和D及钙、磷的吸收还有协同效果[1]。

LC打针液首先由意大利Sigma-Tau 公司研发出产,并于1999 年12月经过FDA同意上市,用于尿毒症、心血管疾病如心疼痛[2-3]、心肌梗死[4]、心力衰竭等[5]、中枢神经体系退行性疾病[6]、肾病[7-9]、肝病[10-11]、糖尿病[12]等疾病的医治,临床使用越来越广泛。LC与LC制剂的测定办法较多,有酶法[13]、放射性同位素法[14]、光学法[15]、滴定法[16]、柱前衍生化HPLC法[17-19]、反相色谱法[20-22]等,其间酶法、同位素法、光学法、滴定法精细度、重复性较差;柱前衍生化HPLC法首要用于血药、尿液浓度监测[17-18]或异构体测定[19],尚无检测杂质A的报导。国家药品规范[22]收载的办法不能很好地将LC和其杂质A分隔、欧盟药典[23]所选用的色谱柱为丙胺基甲基硅烷键合硅胶柱(aminopropylm ethylsilyl silicagel),在国内没有找到相应的色谱柱,且该规范对LC与其杂质A的别离度极限要求(≥0.9)较低。本试验树立了以阴离子交流柱为剖析介质的LC打针液高效液相色谱法(HPLC),可用于该打针液的含量测定及杂质A操控。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(岛津LC-10A二元泵),电子剖析天平(北京赛多利斯仪器体系有限公司),水为打针用水,乙腈为色谱纯,磷酸二氢钾、氢氧化钠均为剖析纯;左卡尼汀打针液,河南欣泰药业有限公司出产,规范:1 g∶5 ml,批号20100801、20100802、20100803;左卡尼汀打针液,意大利Sigma-Tau出产,规范:1g∶5 ml,批号080480;LC对照品(美国药典会,批号CAT. No.1359903),LC杂质A对照品:美国药典会,批号CAT. No.1359925。

2 办法与成果

2.1 色谱条件

色谱柱:PhenoSphere 5u SAX 80A(250 mm×4.60 mm)检测波长:205 nm,柱温:30℃。活动相:乙腈∶磷酸盐(磷酸二氢钾6.81 g/L,以氢氧化钠溶液调理pH为4.7)=65∶35。流速为1.0 ml/min,进样量为20 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 LC对照品溶液 精细称取适量LC对照品,置25 ml 容量瓶中,加活动相溶解并稀释成约5 mg/ml 溶液,振摇、混匀备用。

2.2.2 参比溶液a 精细称取LC杂质A对照品适量用水溶解并稀释成每毫升含0.25 mg的溶液,再精细量取1.0 ml用活动相稀释至10.0 ml,使成25 μg/ml的溶液(杂质A浓度为LC对照品溶液浓度的0.5%),振摇、混匀备用。

2.2.3 参比溶液b 精细称取LC杂质A对照品适量用水溶解并稀释成每毫升含1.0 mg的溶液,再精细量取1.0 ml用活动相稀释至10.0 ml,使成100 μg/ml的溶液,振摇、混匀备用。

2.2.4 参比溶液c 精细称取LC对照品适量,用参比溶液b溶解并稀释成每毫升约含LC对照品10 mg的溶液,振摇、混匀备用。

2.2.5 供试品溶液 精细量取取LC打针液1.25 ml,用活动相稀释至50 ml,振摇、混匀备用。

2.3 专特色

2.3.1 损坏性试验 ①未损坏:取LC约0.1 g,置于10 ml容量瓶中,用2 ml打针用水溶解,再参加活动相至刻度,摇匀,作为供试品溶液;②酸损坏:取LC约0.1 g,置于10 ml容量瓶中,用0.5 mol/L盐酸溶液2 ml溶解,1 h后用1 mol/L氢氧化钠中和,再参加活动相至刻度,摇匀,作为供试品溶液;③碱损坏:取LC约0.1 g,置于10 ml容量瓶中,用0.5 mol/L氢氧化钠溶液2 ml溶解,1 h后用1 mol/L盐酸中和,再参加活动相至刻度,摇匀,作为供试品溶液;④氧损坏:另取LC约0.1 g,置于10 ml容量瓶中,用过氧化氢溶液(3滴加水至25 ml)2 ml溶解,1 h后用参加活动相至刻度,摇匀,作为供试品溶液;⑤高温损坏:取LC质料约0.5 g,用打针用水10 ml溶解,于100℃水浴2 h,取2 ml置于10 ml容量瓶中,参加活动相至刻度,振摇混匀,作为供试品溶液;⑥光损坏:取LC质料约0.5 g,用打针用水10 ml溶解,强光照耀4 h,取2 ml置于10 ml容量瓶中,参加活动相至刻度,振摇混匀,作为供试品溶液。

别离用选定的色谱条件进行试验,成果标明在该色谱条件下LC降解发生的各杂质峰与主成分峰能很好别离,别离度均>1.5,各损坏性试验样品色谱图见图1。

2.3.2 搅扰试验 按处方取辅料,依供试品溶液制备法制备空白辅料溶液,别离取空白辅料溶液、空白活动相、LC对照品溶液、参比溶液c 20 μl,按2.1项下的色谱条件进行试验,成果见图2,辅料及活动相在LC对照品和杂质A对照品的保存时刻处无搅扰;LC与最近的杂质峰(杂质A)的别离度为1.895,LC的理论塔板数为1369,杂质A的理论板数为2417。

2.4 LC和LC杂质A的检出限和定量限

精细量取LC对照品溶液,逐渐稀释制造系列浓度的溶液,别离进样测定,以信噪比(S/N)≥3 核算检出限,S/N≥10核算定量限;另将参比溶液a用活动相稀释成不同浓度溶液,同法测定检出限和定量限。成果LC的检出限和定量限别离为0.5、2.0 μg/ml,LC杂质A的检出限和定量限别离为20、50 ng/ml,色谱图见图3。

2.5 线性关系调查

2.5.1 LC线性关系调查 精细称取LC对照品适量,加活动相溶解并稀释至10 mg/ml,精细汲取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 ml 置10 ml量瓶中,加活动相稀释至刻度,摇匀,别离汲取20 μl 注入液相色谱仪,记载色谱图。以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,将峰面积(y)对应LC浓度(x)进行回归,得方程:y=876.635 1091x+39 115.3624,r2=0.999 96(n=7)。LC进样浓度在1034~8274 μg/ml 范围内与峰面积呈杰出的线性关系。

2.5.2 杂质A线性关系调查 取LC杂质A对照品适量,加活动相溶解并稀释至25 μg/ml,精细汲取上述溶液0.1、1.0、2.0、5.0、10.0 ml置10 ml量瓶中,加活动相稀释至刻度,摇匀,别离汲取20 μl 注入液相色谱仪,记载色谱图。以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标, 将峰面积(y)对应杂质A浓度(x)进行回归,得方程:y=70 089.711 57x-7196.889 747,r2=0.999 87(n=5)。杂质A进样浓度在0.25~25 μg/ml 范围内与峰面积呈杰出的线性关系。

2.6 精细度试验

精细称取LC对照品适量,加活动相溶解并稀释至5 mg/ml,摇匀备用。汲取20 μl注入液相色谱仪,记载色谱图,接连进样6次,记载LC和杂质A对应峰的峰面积,别离核算均匀值和相对规范偏差(RSD),成果LC对应峰和杂质A对应峰峰面积均匀值的RSD别离为0.38%、1.62%(n=6)。

2.7 安稳性试验

取2.6项下制造的溶液,别离在0、2、4、6、8 h测定,成果5次测定值根本不变,LC对应峰和杂质A对应峰峰面积均匀值的RSD别离为0.093%、1.01%(n=5),显现样品溶液在8 h内安稳。

2.8 重复性试验

精细量取同一样品共6 份,别离加活动相溶解并稀释至5.0 mg/ml,测定含量,成果LC对应峰和杂质A对应峰峰面积均匀值的RSD别离为0. 32%、1.83%,阐明重复性杰出。

2.9 LC加样收回率试验

依法制造LC 4.0、5.0、6.0 mg/ml 低、中、高3 种浓度溶液各3 份,每份别离按每支的处方量参加辅料,混匀,滤过,依法测定,LC均匀收回率为101.29(n=9),RSD为0.55%,成果见表1,标明辅料对测定无搅扰,收回彻底。

2.10 LC杂质A加样收回率试验

依法制造LC杂质A 12.5、25.0、37.5 μg/ml 低、中、高3 种浓度溶液各3 份,每份别离按每支的处方量参加辅料,混匀,滤过,依法测定,杂质A均匀收回率为100.35(n=9),RSD 为1.79 %,成果见表2,标明辅料对测定无搅扰,收回彻底。

2.11 样品含量测定

精细汲取LC打针液三个批次样品各1 ml,加活动相制成每毫升含5 mg 的溶液作为供试品溶液,取20 μl注入液相色谱仪,记载色谱图;另取2.2项下的LC对照品溶液和参比溶液a,同法测定,按外标法核算LC和杂质A的量,成果见表3。

3 评论

在主药强酸、强碱损坏试验及强光光照试验以及高温试验进程中发现,在本试验HPLC色谱条件下,在相对于主峰保存时刻1.20处能检出有关物质,经与LC杂质A对照品比照可知本杂质即为杂质A。为确保产品质量,欧洲药典[23]、美国药典[24]均对LC杂质A的极限做出规则,现有LC打针液国家药品规范[22]只对总杂质极限做出规则(本身对照法,<2%),未对已知杂质A的极限做出明确规则。文献[20]和本文2.3.2项数据均显现LC杂质A的响应值远大于LC,选用本身对照法单纯操控总杂质极限难以有用操控LC制剂的质量。此外,国家药品规范[16,22]规则的LC有关物质测定办法不能将LC和杂质A有用分隔,咱们曾尝试用C18柱来剖析LC及杂质A,但两者别离度很小,改动活动相配比也难以将两者的别离度提高到0.9 以上而抛弃。

依据LC在水溶液中显弱酸或弱碱性,在水溶液中分子带有必定电荷的特色,参阅EP 6.0[23]收载的LC规范,咱们挑选强阴离子交流柱PhenoSphere 5u SAX 80A为剖析介质,在活动相为乙腈∶磷酸盐(磷酸二氢钾6.81 g/L,以氢氧化钠溶液调理pH为4.7)=65∶35、流速1.0 ml/min的色谱条件下,LC和降解发生的各杂质峰得到有用别离,LC和最近杂质峰(杂质A)的别离度>1.5,辅料及活动相不搅扰LC及杂质A的测定。

在该色谱条件下,LC的检出限和定量限别离为0.5、2.0 μg/ml,LC杂质A的检出限、定量限别离为20、50 ng/ml;LC在1034~8274 μg/ml 范围内线性关系杰出,杂质A在0.25~25 μg/ml范围内线性关系杰出 。

试验成果标明该办法简洁、精确、专属,可用于LC打针液的含量测定和有关物质——杂质A的检测。

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(收稿日期:2015-04-03 本文修改:许俊琴)

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