LC-MS 使用根据LC—TOF—MS剖析的质量亏本过滤办法挑选黄芪注射液中的皂苷类成分
宋慧婷+李长印+万瑶瑶+丁选胜+谭喜莹+戴国梁+刘史佳+居文政
[摘要] 选用液相色谱与四极杆飞翔时刻质谱（LC-TOF-MS）联用技能剖析黄芪注射液（HI）样品，获取正负离子方式下HI中化学成分的LC-TOF-MS剖析数据。依据前期相关文献报导，树立黄芪皂苷类化合物的质量亏本过滤（MDF）办法，用于体系挑选HI中所含有的皂苷类成分。每个挑选化合物的存在需由不少于2个准分子离子进行承认。终究依据其母离子和子离子信息对所挑选的化合物进行开始判定。终究共从HI中挑选并开始判定出62个皂苷类化合物，其间15个为新发现的皂苷类化合物。判定成果提示，乙酰化、氢化、去氢化、甲氧基化和水化或许为HI中皂苷所触及的首要转化反响。该研讨丰厚了黄芪化学物质根底研讨内容，一起也标明依据LC-TOF-MS剖析的MDF办法，是一种可行且有用的中药成分体系挑选东西。
[关键词] 黄芪注射液； 黄芪皂苷； 质量亏本过滤； LC-TOF-MS； 转化反响
[Abstract] The samples of Huangqi injection （HI） were analyzed by liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry （LC-TOF-MS）， and both positive and negative ion modes were employed to obtain the LC-TOF-MS analysis information of chemical compounds in HI. Then the mass defect filtering （MDF） approach， which was developed based on the previously published articles， was utilized to rapidly screen the astragalosides from the obtained LC-TOF-MS data. Each screened astragaloside was confirmed by the presence of no less than 2 quasi-molecular ions. All the screened astragalosides were then tentatively assigned according to the parent ion and daughter ion information. Finally， a total of 62 astragalosides were screened and characterized from the HI samples， including 15 new detected ones. The identification results indicated that acetylation， hydrogenation， dehydrogenation， methoxylation and hydration might be the major conversion reactions involved in the formation of the astragalosides. The LC-TOF-MS-based MDF approach was proved to be a feasible and efficient tool to screen the chemical constituents in complex matrices such as herbal medicines.
[Key words] Huangqi injections； astragalosides； mass defect filter； LC-TOF-MS； conversion reactions.
明確中药中所含有的化学成分信息，是说明中药的药效物质根底，点评中药质量和安全性的条件和根底。高效液相-飞翔时刻质谱（LC-TOF-MS）联用技能十分适用于中药化学成分定性剖析，特别对错方针性体系性定性剖析[1-2]。可是，因为中药成分杂乱，其LC-TOF-MS剖析数据信息反常丰厚，怎么对其快速有用解析，以精确全面地提取中药成分信息一直是研讨者的一大应战。近年来，质量亏本过滤（mass defect filtering，MDF）办法作为一种TOF-MS等高分辩质谱数据的新式数据处理技能，已被一些研讨证明可用于中药成分的体系剖析，并具有必定的共同优势[3-4]。可是这些研讨均具有必定的局限性，它们或许需求对照品比对[3]，或许没有考虑到化合物或许的加合离子[4]。黄芪注射液（HI）为已上市的临床常用黄芪制剂，皂苷类为其首要药效成分和制剂质量操控方针[5-6]。可是现在还没有对HI中皂苷类成分体系剖析的研讨报导。依据此，本研讨结合前期文献报导和预试验成果，充沛考虑皂苷类化合物或许发作的各种加合离子，树立了改进的黄芪皂苷类化合物的质量亏本过滤（MDF）办法，对HI中的皂苷类成分进行体系挑选和判定。
1 资料
LC （Agilent）-（AB） Triple TOFTM 5600液质联用仪，含Pump Agilent 1200G1312A，Column Oven Agilent 1200G1316A，Auto Sampler Agilent 1260G1367B和Triple TOF 5600 Mass spectrometer，LC-MS/MS体系由Analyst 1.6 Software 操控；CPA225D电子天平（德国Sartorius公司）；高速低温离心机（ThermoSorvall Legend Micro 17R）；WH2微型旋涡混合仪（上海沪西剖析仪器厂）。
甲醇、乙腈（HPLC级，德国Merck公司）；甲酸、甲酸铵（质谱级，瑞士Fluka-Sigma-Aldrich公司）；超纯水由Millipore Milli-Q Advantage A10超纯水机制备；其他试剂为剖析纯。黄芪注射液为正大芳华宝药业有限公司出产，批号1212053，规范10 mL/支。TOF-MS正负离子调谐液（美国AB Sciex公司，产品编号别离为4460131，4460134）。Oasis@固相萃取（SPE）小柱（HLB 3cc，美国Waters公司）。
2 办法
2.1 样品处理 黄芪注射液经SPE处理后方可进行LC-TOF-MS剖析。HLB型SPE小柱运用前需首要用3 mL甲醇活化，而后用3 mL水洗预平衡。将黄芪注射液涡旋30 s混匀，精细汲取600 μL上SPE小柱，而后用2 mL水洗除杂，待水洗结束后用1 mL甲醇进行洗脱。将甲醇洗脱液涡旋30 s混匀，12 000×g，4 ℃离心5 min，取上清液5 μL进样剖析。
2.2 色谱条件 Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），Agilent Poroshell 120 SB-C18预柱（3.0 mm×5.0 mm，2.7 μm）；活动相A为含2 mmol·L-1甲酸铵和0.1%甲酸的水相，B为含2 mmol·L-1甲酸铵和0.1%甲酸的等比混合的甲醇-乙腈；梯度洗脱（0～0.5 min，5% B；0.5～12 min，5%～100% B；12～16 min，100% B；16～16.1 min，100%～5% B；16.1～22 min，5% B）；流速300 μL·min-1；柱温35 ℃；进样体积5 μL；进样室温度8 ℃。
2.3 质谱条件 离子源为电喷雾离子化（ESI）源，正负离子方式均用于数据收集。TOF-MS扫描方式参数设置如下：扫描规模 m/z 100～1 000，累积时刻 0.250 015 s，离子化温度（TEM） 550 ℃，雾化气（GS1） 60 psi（1 psi=6.895 kPa），辅佐加热气（GS2） 60 psi，气帘气（CUR） 35 psi，去簇电压（DP） 80 V，磕碰能量（CE） 10 eV，正负离子方式下喷雾电压（ISVF）别离为5 500，4 500 V。选用IDA，DBS和高灵敏度的方式收集数据。首要的IDA转化规范如下：信号强度大于500 cps，4以内扫除同位素，相对分子质量差错0.05，每个循环最多监测8个候选离子。子离子扫描方式的参数设置如下：扫描规模 m/z 50～1 000，累积时刻0.100 006 s，CE（35±15） eV，其他首要参数同TOF-MS扫描方式。选用AB公司的调谐液传递体系（CDS）对相对分子质量精确度进行主动校准。经过AB公司的软件Analyst TF 1.6 software操控仪器操作和数据收集。
2.4 数据剖析 选用AB公司的软件Peakview Software TM v. 1.2对取得LC-TOF-MS剖析數据进行处理。数据处理进程会用到Peakview软件的4个功用Mass Defect Filtering （MDF），Formula Finder，XIC manager和IDA Explorer。
首要，选用MDF功用挑选黄芪皂苷相关特征离子，质量亏本和相对分子质量挑选规模见表1，正负离子方式下离子信号强度下限别离为12 000，7 000 cps。仅在IDA Explorer项下挑选能发作子离子的特征离子，以便利后续判定进程。接着，使用Formula Finder功用对挑选所得方针离子的元素组成进行猜测，首要参数设置见表1，此外相对分子质量最大答应差错5，正离子方式下氮、钠和钾原子0～1个，负离子方式下氮、氯原子0～1个。选用XICManager功用提取挑选所得的方针离子，以查验其
峰形完整性，承认其精确保存时刻；在0.03 min的 保存时刻答应差错规模内，匹配、兼并源自1个化合物的多个特征准分子离子（如正离子方式下的[M+H]+，[M+Na]+，[M+K]+，[M+NH4]+，及负离子方式下的[M-H]-，[M+Cl]-，[M+HCOOH-H]-，[M+NO3]-等），并对其他或许的上述特征离子进行XIC提取承认，进而概括各种加合离子信息确定方针化合物。一起，关于同一时刻点所挑选到的多个方针化合物，细心调查相互间的分子式/相对分子质量相关，以去除源于源内裂解离子的假阳性挑选成果。终究，结合IDA Explorer供给的子离子信息对方针化合物进行开始判定。
3 成果与评论
3.1 剖析条件的挑选 本研讨中挑选的Poroshell 120 SB-C18色谱柱为Agilent公司开发的一类新式UPLC色谱柱，与亚2 μm柱具有相似的高柱效，但压力削减40%～50%，因而适用于Agilent 1200等常压液相色谱[7]。为了能与后续HI药效相关非靶标代谢组学研讨进行联接，并证明本文中MDF挑选办法的挑选才能和功率，未对洗脱梯度等剖析条件进行体系优化，挑选了代谢组学研讨中选用的通用的剖析条件（详见后续研讨报导）；活动相中参加甲酸和甲酸铵是为了进步离子化功率、改进色谱峰峰形和发作特征加合离子。正负离子一起检测以发作丰厚的加合离子确证方针化合物的存在，并供给丰厚的碎片离子以利化合物的结构判定。
3.2 MDF挑选办法的断定 MDF技能开始是用于代谢产品判定研讨的，用来移除生物样本中很多的布景搅扰离子[8-9]。而中药成分尽管十分杂乱，但常常可归属为一类或几类具有相同结构母核的一系列化合物，他们能够看做（实际上也应该是）极少数几个具有共同结构母核的化合物的次生代谢产品，这与药物及其体内代谢产品的联络是相似的，因而MDF技能理应适用于中药成分的体系定性剖析。本研讨中，MDF办法的质量亏本和相对分子质量挑选规模的设定依据为已有文献报导的黄芪皂苷类化合物。从前研讨中，依据24个已有报导的黄芪中皂苷类成分的分子式，凭借Peakview软件的Mass calculator功用核算取得其5种常见准分子离子包含正离子方式下的[M+H]+，[M+Na]+，[M+NH4]+及负离子方式下的[M-H]-，[M+HCOOH-H]-的精确分子质量；据此得到正负离子方式下质量亏本的最大值和最小值，以及相对分子质量的最大值和最小值，进而设定了MDF的相关参数[10]。可是，由挑选成果可知，[M+HNO3-H]-为此前未见报导的一种呈现频率极高的黄芪皂苷准分子离子，其呈现频率仅次于[M+HCOOH-H]-；此外，[M+K]+和[M+Cl]–也经常呈现。更为重要的是，比较[M-H]-和[M+H]+离子，大都情况下，黄芪皂苷的[M+HCOOH-H]-，[M+Na]+和[M+HNO3-H]-等加合离子往往具有更强的离子呼应强度。挑选办法设守时不考虑这些准分子离子的存在会影响挑选办法的灵敏度和挑选成果的全面性。因而，依据各个已有报导的皂苷的上述一切8种准分子离子的精确相对分子质量和分子式，对上述MDF办法进行了批改，然后大大进步了化合物挑选的灵敏度。因为CDS主动校准能够完成0.01以内的分子质量主动校准，因而将质量亏本的差错规模设定为±0.01；而分子质量差错规模则设定为10，以包含或许呈现的不行预知的皂苷类化合物。终究MDF办法详细参数设置见表1。
3.3 挑选成果 经MDF过滤后的LC-TOF-MS总离子流色谱图（TIC）的基线噪音水平显着下降，而黄芪皂苷类化合物对应的色谱峰也在TIC图谱中愈加明晰显着，见图1。理论上来讲，但凡质量亏本落在设定规模内的信号离子均应作为皂苷相关离子被挑选出来进一步研讨。而在本研讨中，仅对能发作子离子且信号强度在12 000 cps（正离子方式）或7 000 cps（负离子方式）以上的皂苷相关离子进行挑选，以发现相对含量较高的黄芪皂苷类成分。终究依据1.2.4中所述办法，共从黄芪注射液中确定62个皂苷类化合物。
a.正离子方式下未过滤的TIC；b.负离子方式下未过滤的TIC；c.正离子方式下经皂苷类MDF办法滤过的TIC；d.负离子方式下经皂苷类MDF办法滤过的TIC。
为了进一步确证62个皂苷类成分的存在，选用XIC manager从头提取了每个成分的8种准分子离子的XIC图谱，以确证各种准分子离子的存在。成果标明，大大都皂苷类成分均存在3个以上的准分子离子，进一步证明晰挑选成果的可靠性。各种离子类型呈现的频率从高到低依次为：[M+HCOOH-H]->[M+Na]+>[M+NO3]->[M-H]->[M+H]+>[M+Cl]->[M+K]+>[M+NH4]+。由此可见，在当时LC-MS条件下，[M+HCOOH-H]-是负离子方式下黄芪皂苷类化合物最常见的离子方式，而[M+Na]+则是正离子方式下黄芪皂苷的首要离子方式。此成果进一步证明晰化合物挑选办法时考虑各品种型加合离子的重要性和必要性。总结62个化合物的详细信息，见表2，包含保存时刻，分子式，不饱和度，5类首要准分子离子的分子质量测定值及其与理论值间的差错值，[M+HCOOH-H]-的信号强度，以及各化合物与已知黄芪皂苷的元素組成的相关性。
3.4 挑选化合物的判定 化合物的判定首要依据其元素组成与已报导的黄芪皂苷类化合物间的联络，子离子色谱图的特征确诊离子以及chemspider等已知化合物数据库。由前期研讨[11]可知，在全扫描（TOF-MS scan type）方式下，皂苷类在正离子状态下极易发作苷元确诊碎片离子离子m/z 473.362 0 （C30H49O4），和一系列进一步脱水离子峰m/z 455.352 0 （C30H47O3），437.341 0 （C30H45O2），419.331 0 （C30H43O），以及C-17和C-20键裂解发作的25-hydroxy-20，24-epoxy残基离子m/z 143.106 0 （C8H15O2），这些离子的很多呈现可为皂苷类化合物的存在供给依据，可是也会导致其相应准分子离子峰的信号大幅度削弱甚至缺失，然后无法获取针对某一离子的精确子离子信息。相反，在负离子状态下，黄芪皂苷类化合物在全扫描方式下往往仅发作丰度较强的[M-H]-或[M+HCOOH-H]-等准分子离子峰。这些准分子离子峰在子离子方式（product ion scan type）下则可发作源自此指定母离子的系列特征子离子，用于皂苷类化合物的结构判定。研讨发现[10]，黄芪甲苷（AGIV）在负离子TOF-MS方式下首要以m/z 829.459 8[M+HCOOH-H]-存在，此离子可在子离子方式发作m/z 783.456 4，651.410 4，621.398 1，489.357 0，179.056 1，161.045 6，149.045 8，143.034 1，131.034 1，119.035 6，113.024 7，101.024 9，89.0252，71.015 2，59.015 1等一系列特征离子，对应皂苷结构母核中的不同结构特征，见图2a。相似地，一切皂苷类化合物均可发作相似的特征碎片离子，见表3，据此能够开始描绘化合物的化学结构，对其进行合理归属。以A13为例，见图2b，其[M+HCOOH-H]-可发作一系列特征碎片离子用于化学结构的解析。与黄芪甲苷相同，碎片离子179.06和149.05的呈现标明A13结构中含有葡萄糖残基和木糖残基，而59.02和71.02的存在则标明A13结构中25-hydroxy-20，24-epoxy残基离子；离子505.4，637.4，667.4和黄芪甲苷的苷元特征离子489，621，651均相差1个氧原子的相对分子质量，提示羟基应存在于皂苷元母核上，而非其他3个环上。离子799的呈现进一步证明845为A13的[M+HCOOH-H]-，且A13应为黄芪甲苷的羟基化产品。据此，给出A13的或许化学结构，见图2c。相似地，对一切62个化合物的结构进行了合理归属，见图3。其间共有47个已有报导的黄芪皂苷成分及其同分异构体，其间包含8个AGIV同分异构体（A15，A18，A22，A26，A37，A41，A48，A49），9个AGII同分异构体（A31，A35，A45，A50，A51，A53，A56，A57，A60），3个AGI同分异构体（A58，A61，A62），6个AGV同分异构体（A16，A17，A20，A34，A39，A44），乙酰AGI（A63），大豆皂苷（A40），以及19个从前黄芪口服液中初次发现的黄芪皂苷类化合物[10]；包含A13在内的剩下15个化合物则为黄芪注射液中新发现的黄芪皂苷类化合物。归属一切62个新化合物的或许化学结构所需的子离子信息见表3。
a.负离子方式下黄芪甲苷（AGIV）的首要裂解途径及特征子离子；b.A13的母离子 [M+HCOOH-H]-m/z 845.5的子离子图谱；c.A13或许的化学结构。
3.5 挑选成果剖析 依据挑选判定出的62个皂苷类化合物，能够对黄芪注射液中皂苷类成分的转化反响进行总结概括。假定黄芪皂苷的转化始于AGIV，其他化合物则可看作是AGIV经过某些转化反响而生成的产品。事实上，已知的首要皂苷类成分AGII，AGI和AGV也能够别离看作是AGIV发作1，2，3次乙酰化后得到的系列转化产品。成果标明，共有乙酰化、（去）甲氧基化、（去）氢化、水合反响等9种转化反响参加黄芪皂苷类化合物的生成，见图3。结合各化合物[M+HCOOH-H]-的离子强度，能够开始以为，乙酰化、甲氧基化、氢化、去氢化和水合反响是黄芪注射液中黄芪皂苷类成分的首要转化途径。参阅已知的首要皂苷类成分AGII，AGI和AGV的化学结构[11-13]，以及ChemSpider数据库中结构相似的化合物，结合惯例转化反响规则，开始揣度或许的首要反响位点如下：AGIV结构中的A环被以为是乙酰化和甲氧基化的或许反响位点，而氢化反响或许发作于C9-C19位开环，去氢化则或许是C16位羟基羰基化，水合反响最有或许发作于C20-C24环氧基团。需求指出的是，并无切当依据证明AGIV为一切黄芪皂苷的母体化合物，因而上述转化反响在实际情况下有或许是逆向发作的。此外，本研讨中未检测到丙二酸盐类皂苷成分，AGI的同分异构体及从前研讨中未判定的1种皂苷成分，这些化合物的缺失或许与黄芪注射液的制备工艺有关。
1.乙酰化；2.去氢化；3.氢化；4.水合；5.甲氧基化；6.去羟基化；7.糖基化；8.羟基化；9.去甲氧基化。
4 定论
本研讨在对HI进行LC-TOF-MS剖析获取剖析数据的根底上，选用MDF挑选办法共从HI中挑选出62个皂苷类化合物，其间15个为新发现化合物。
研讨成果充沛证明晰依据LC-TOF-MS剖析的MDF挑选办法应用于中药化学成分的体系定性剖析的可行性和共同优势；一起，挑选出的62个皂苷类化合物直接说明晰HI中的黄芪皂苷次生代谢产品品种，丰厚了关于黄芪皂苷类成分多样性的知道，关于科学点评黄芪制剂质量、促进制剂合理开发均具有必定的指导意义。
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