神经元凋亡：JNK 磷酸化Bad在脑缺血神经元凋亡中的效果
王晓天+刘晓梅+尤红娟+李小翠+秦苏萍+汤仁仙+宋远见
[摘要] 意图 评论JNK磷酸化Bad在大鼠缺血性神经元凋亡中的效果。 办法 20只大鼠均分为4组：假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组。制造大鼠全脑缺血模型，使用免疫沉积和免疫印迹法检测大鼠脑缺血复灌1 d海马CA1区神经元Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl的结合、Bad丝氨酸128位磷酸化[p-Bad（S128）]水平、Caspase-3蛋白表达状况。 成果 与缺血复灌组比较，SP600125组海马CA1区神经元Bad与14-3-3的结合显着增高，Bad与Bcl-Xl的结合、p-Bad（S128）、Caspase-3表达显着削减（均P<0.05）。 定论 JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损害中发挥了重要效果。
[关键词] Bad；JNK丝裂原活化蛋白激酶类；凋亡；脑缺血
[中图分类号] R743.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）31-0001-03
Effects of Bad phosphorylation induced by JNK on cerebral ischemic neuronal apoptosis
WANG Xiaotian LIU Xiaomei YOU Hongjuan LI Xiaocui QIN Suping TANG Renxian SONG Yuanjian
Department of Pathogenic Biology and Immunology， Xuzhou Medical College， Xuzhou 221002， China
[Abstract] Objective Investigate the effects of Bad phosphorylation induced by JNK on cerebral ischemic neuronal apoptosis in rats. Methods Twenty rats were divided into 4 groups averagely： sham operation group， ischemia-reperfusion group， solvent control group and SP600125 group. Making rat model of cerebral ischemia， the binding of Bad and 14-3-3，the binding of Bad and Bcl-Xl， Bad phosphorylation at serine 128（p-Bad（S128）） and Caspase-3 protein expression in hippocampal CA1 region were detected by immunoprecipitation（IP） and immunoblotting（IB） 1d after ischemia-reperfusion. Results Compared with the ischemia-reperfusion group， the binding of Bad and 14-3-3 was increased， the binding of Bad and Bcl-Xl， p-Bad（S128） and Caspase-3 protein expression in hippocampal CA1 region were decreased in SP600125 group （All P<0.05）. Conclusion Bad phosphorylation at serine 128 induced by JNK playe important effects on cerebral ischemic neuronal apoptosis in rats.
[Key words] Bad； JNK mitogen-activated protein kinases； Apoptosis； Cerebral ischemia
Bcl-2 antagonist of cell death（Bad）是Bcl-2宗族促凋亡蛋白之一，在缺血性脑中风引起的神经元凋亡中发挥了重要效果。Bad丝氨酸136位被Akt磷酸化后即可与14-3-3蛋白结合，构成一个非活化的复合体，阻挠Bad介导的凋亡[1，2]；相反，在凋亡影响下，Bad去磷酸化与14-3-3别离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl构成异二聚体，中和后者的抗凋亡效果[3]。最近有人报导，c-Jun氨基结尾激酶（JNK）可使Bad丝氨酸128位磷酸化，诱导细胞凋亡[4]。为此，本试验使用大鼠全脑缺血模型，经过打针JNK按捺剂SP600125，调查其对海马CA1区神经元Bad（S128）磷酸化水平、Bad线粒体转位及Caspase-3蛋白表达的影响，评论JNK介导的Bad磷酸化在大鼠脑缺血性神经元凋亡中的重要效果。
1 资料与办法
1.1 资料
1.1.1 试验动物 正常健康雄性SD大鼠20只，体重250～300g，由徐州医学院试验动物中心供给。
1.1.2 首要试剂 Bad、14-3-3抗体（Santa Cruz Biotechnology公司），Bcl-Xl抗体（Cell Signaling Biotechnology公司），p-Bad（S128）抗体（Biosource公司），active-Caspase-3抗体（Sigma公司），SP600125（Biomol公司）。
1.2 办法
1.2.1模型制备及分组 20只大鼠均分为4组：假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组。选用四动脉结扎法制造全脑缺血模型[5]，将大鼠麻醉后，别离其双侧颈总动脉并电凝椎动脉，次日于清醒状况下结扎双侧颈总动脉，全脑缺血15 min，再灌注1 d处死，为缺血复灌组。假手术组的处理同缺血复灌组，但不结扎双侧颈总动脉。SP600125组将3 g/L的SP600125溶于1%二甲基亚砜（DMSO），于缺血前20 min脑室打针，10 μL/只，10min内打针完[6]。溶剂对照组于缺血前20min脑室打针等体积1% DMSO。
1.2.2 样本制备 大鼠脑缺血15 min再灌注1 d后，断头快速取脑，别离双侧海马，沿海马裂将其分为CA1和CA3-DG两部分，CA1部分置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马CA1部分加匀浆缓冲液，匀浆，1000×g离心15 min，当心移取上清液，首要为海马的胞浆部分，BCA法测蛋白浓度后走免疫沉积及免疫印迹剖析。
1.2.3免疫沉积 取等量胞浆部分蛋白质样品，参加5倍体积IP缓冲液，以25 μL蛋白A/G-琼脂糖预吸附1 h，10 000×g离心2 min，取上清，参加1～2 μg 抗体，旋转混匀过夜，再参加25 μL蛋白A/G-琼脂糖，旋转混匀2 h，10 000×g离心2min，沉积用IP缓冲液洗3遍，蛋白变性处理后，10 000×g离心2 min，吸上清行免疫印迹剖析， 以Bad/14-3-3、Bad/Bcl-Xl别离表明胞浆中Bad与14-3-3、Bad与Bcl-Xl蛋白结合状况。
1.2.4免疫印迹 取等量的变性蛋白质样本（100μg）或IP样本，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳别离后，转移至硝酸纤维素膜，关闭，一抗4℃过夜，二抗室温孵育2 h，显色。扫描膜上显色条带并用ImageJ软件剖析，蛋白表达相对值以各组蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值来表明。
1.3 统计学处理
一切数据均以x±s表明。选用SPSS16.0软件进行统计学剖析，多样本均数比较用单要素方差剖析，多样本均数的两两比较选用q查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 4组p-Bad（S128）蛋白表达水平的比较
与假手术组比较，缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组p-Bad（S128）水平显着增高；与缺血复灌组和溶剂对照组比较，SP600125组的p-Bad（S128）水平显着下降（P均<0.05）。溶剂对照组与缺血复灌组差异无统计学含义，4组Bad蛋白表达水平差异无统计学含义（P均>0.05）。详见图1、表1。
图1 4组大鼠海马CA1区神经元p-Bad（S128）、Bad蛋白表达
表1 4组大鼠海马CA1区神经元p-Bad（S128）蛋白表达水平比较（x±s，n=5）
注：F=103.76，P<0.05；1vs2，q=0.871，P>0.05；1vs3，q=12.226，P<0.05； 1vs4，q=21.435，P<0.05；2vs3，q=11.356，P<0.05；2vs4，q=20.565，P<0.05； 3vs4，q=9.209，P<0.05
2.2 4组Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl结合、Caspase-3蛋白表达水平的比较
与假手术组比较，缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组Bad与14-3-3的结合削减，Bad与Bcl-Xl结合、Caspase-3表达水平增多；与缺血复灌组和溶剂对照组比较，SP600125组Bad与14-3-3的结合显着增多，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3表达水平显着下降（P均<0.05）。溶剂对照组与缺血复灌组比较，Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl结合、Caspase-3表达水平差异无统计学含义（P均>0.05）。4组14-3-3、Bcl-Xl蛋白表达水平差异无统计学含义（P均>0.05）。详情请参见图2、表2和表3。
图2 4组大鼠海马CA1区神经元Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl结合、14-3-3、Bcl-Xl和Caspase-3蛋白表达
表2 4组大鼠海马CA1区神经元Bad与14-3-3结合状况比较
（x±s，n=5）
注：F=53.508，P<0.05；1vs2，q=8.006，P<0.05；1vs3，q=14.932，P<0.05； 1vs4，q=15.832，P<0.05；2vs3，q=6.926，P<0.05；2vs4，q=7.826，P<0.05； 3vs4，q=0.901，P>0.05
3 评论
哺乳动物中，Bcl-2宗族成员多达20余种，他们均别离含有1-4个Bcl-2同源结构域（Bcl-2 homology domain，BH domain）。依据所含BH结构域及功用的不同，Bcl-2宗族蛋白被分为三类：含有BH1-BH4 保存结构域的凋亡按捺蛋白如Bcl-2，Bcl-Xl，Bcl-w等；含有BH1-BH3结构域的凋亡促进蛋白如Bax，Bak等；只含有BH3结构域的凋亡促进蛋白如Bad，Bim，DP5，Bid等[7]。Bad是Bcl-2蛋白宗族中的促凋亡成员，它的功用首要是由磷酸化状况的改变来调理的，由此调控下流蛋白之间的相互效果和亚细胞定位[8]。研讨发现，细胞存活信号激酶Akt可磷酸化Bad丝氨酸136位，Bad磷酸化后与胞浆蛋白14-3-3结合，消除Bad的促凋亡功用[9]。而在凋亡影响下，Bad去磷酸化后与14-3-3别离，并转移至线粒体外膜，与Bcl-Xl结合构成异二聚体，按捺后者抗凋亡活性。因而，一直以来，人们认为非磷酸化的Bad是它的活化方式，Bad磷酸化后即失掉凋亡活性。可是，最近有人发现Bad丝氨酸128位被JNK磷酸化后，却可成为它的活化方式，诱导细胞凋亡[4]。
JNK是丝裂原活化的蛋白激酶宗族的成员，可被紫外线照耀、炎性因子、生长因子撤消等多种凋亡影响所激活[10-11]。JNK信号通路在脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡中发挥了重要效果。时间短脑缺血后JNK即被激活[12]，激活的JNK依次磷酸化其核底物如c-Jun和胞浆底物如Bcl-2、14-3-3等，诱导神经元凋亡。本试验为了证明脑缺血中JNK能否磷酸化另一胞浆底物Bad，咱们挑选了JNK特异性按捺剂SP600125作为东西药进行研讨，成果显现：与缺血复灌组比较，SP600125组的p-Bad（S128）蛋白表达显着下降，提示在脑缺血复灌过程中JNK可以使Bad（Ser-128）磷酸化。
接着，咱们检测到：与缺血复灌组比较，SP600125组Bad与14-3-3的结合显着增高，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3蛋白表达显着削减。成果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后搅扰了Bad与14-3-3的结合，Bad随后与14-3-3别离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl结合，促进了线粒体内凋亡因子的开释，进而诱导神经元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以会诱导Bad线粒体转位，可能是因为Bad丝氨酸128位与丝氨酸136位在空间构型上比较挨近，丝氨酸128位磷酸化润饰从空间构型上搅扰了丝氨酸136位与14-3-3的相互效果[4]。但是，丝氨酸128位磷酸化也可能是经过与其他蛋白相互效果，破坏了14-3-3与磷酸化的丝氨酸136位的结合[9]。研讨发现，在正常细胞内，Bcl-xL与Bax结合构成异源二聚体，阻挠Bax同源二聚体的构成，按捺Bax的促凋亡效果[13]。当遭到凋亡影响时，Bad以其本身的BH3结构域与Bcl-xL结合，使得本来与Bcl-xL相结合的Bax开释出来，Bax构成同源二聚体并刺进线粒体外膜，引起线粒体通透性改变孔道的敞开[14]，导致细胞色素C的开释。细胞色素C与Apaf-1结合，后者一起与逝世效应子前体Caspase-9相互效果构成凋亡小体，活化的Caspase-9继而活化下流的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切开核DNA修正酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，从而使核DNA不行复性损害，终究导致细胞凋亡。正常状况下，Caspase-3蛋白酶以无活性的前体方式定位在胞浆中，只有当细胞凋亡时才被切开激活为有活性的Caspase-3，因而，本试验用抗active-Caspase-3抗体作免疫印迹剖析，检测胞浆中切开后Caspase-3的活性片段。
总归，本试验证明了脑缺血复灌过程中JNK可以使Bad（S128）磷酸化，且Bad（S128）磷酸化后，搅扰了Bad与14-3-3结合，Bad转位到线粒体，诱导神经元凋亡。因而，JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损害中发挥了重要效果。Bad磷酸化状况是决议细胞存活或是逝世命运的关键性要素之一，Bad或许会成为防备和医治缺血性脑中风的一个新的药物效果靶点。
[参考文献]
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（收稿日期：2014-08-18）
接着，咱们检测到：与缺血复灌组比较，SP600125组Bad与14-3-3的结合显着增高，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3蛋白表达显着削减。成果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后搅扰了Bad与14-3-3的结合，Bad随后与14-3-3别离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl结合，促进了线粒体内凋亡因子的开释，进而诱导神经元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以会诱导Bad线粒体转位，可能是因为Bad丝氨酸128位与丝氨酸136位在空间构型上比较挨近，丝氨酸128位磷酸化润饰从空间构型上搅扰了丝氨酸136位与14-3-3的相互效果[4]。但是，丝氨酸128位磷酸化也可能是经过与其他蛋白相互效果，破坏了14-3-3与磷酸化的丝氨酸136位的结合[9]。研讨发现，在正常细胞内，Bcl-xL与Bax结合构成异源二聚体，阻挠Bax同源二聚体的构成，按捺Bax的促凋亡效果[13]。当遭到凋亡影响时，Bad以其本身的BH3结构域与Bcl-xL结合，使得本来与Bcl-xL相结合的Bax开释出来，Bax构成同源二聚体并刺进线粒体外膜，引起线粒体通透性改变孔道的敞开[14]，导致细胞色素C的开释。细胞色素C与Apaf-1结合，后者一起与逝世效应子前体Caspase-9相互效果构成凋亡小体，活化的Caspase-9继而活化下流的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切开核DNA修正酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，从而使核DNA不行复性损害，终究导致细胞凋亡。正常状况下，Caspase-3蛋白酶以无活性的前体方式定位在胞浆中，只有当细胞凋亡时才被切开激活为有活性的Caspase-3，因而，本试验用抗active-Caspase-3抗体作免疫印迹剖析，检测胞浆中切开后Caspase-3的活性片段。
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接着，咱们检测到：与缺血复灌组比较，SP600125组Bad与14-3-3的结合显着增高，Bad与Bcl-Xl的结合、Caspase-3蛋白表达显着削减。成果提示，JNK磷酸化Bad（S128）后搅扰了Bad与14-3-3的结合，Bad随后与14-3-3别离，转位到线粒体外膜与Bcl-Xl结合，促进了线粒体内凋亡因子的开释，进而诱导神经元凋亡。Bad（S128）磷酸化后之所以会诱导Bad线粒体转位，可能是因为Bad丝氨酸128位与丝氨酸136位在空间构型上比较挨近，丝氨酸128位磷酸化润饰从空间构型上搅扰了丝氨酸136位与14-3-3的相互效果[4]。但是，丝氨酸128位磷酸化也可能是经过与其他蛋白相互效果，破坏了14-3-3与磷酸化的丝氨酸136位的结合[9]。研讨发现，在正常细胞内，Bcl-xL与Bax结合构成异源二聚体，阻挠Bax同源二聚体的构成，按捺Bax的促凋亡效果[13]。当遭到凋亡影响时，Bad以其本身的BH3结构域与Bcl-xL结合，使得本来与Bcl-xL相结合的Bax开释出来，Bax构成同源二聚体并刺进线粒体外膜，引起线粒体通透性改变孔道的敞开[14]，导致细胞色素C的开释。细胞色素C与Apaf-1结合，后者一起与逝世效应子前体Caspase-9相互效果构成凋亡小体，活化的Caspase-9继而活化下流的Caspase-3等蛋白酶。激活的Caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切开核DNA修正酶PARP[poly（ADP-ribose） polyrerase]，从而使核DNA不行复性损害，终究导致细胞凋亡。正常状况下，Caspase-3蛋白酶以无活性的前体方式定位在胞浆中，只有当细胞凋亡时才被切开激活为有活性的Caspase-3，因而，本试验用抗active-Caspase-3抗体作免疫印迹剖析，检测胞浆中切开后Caspase-3的活性片段。
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（收稿日期：2014-08-18）