凝血活性酶偏高 根据凝血活性和星点规划—效应面法的黄槐复方提取工艺研讨

李鹏程+刘涛+伍月+张倩+付春梅+刘翠

[摘要]運用纤维蛋白原平板法，以凝血酶为参照，树立体外凝血活性测定的办法，以体外凝血活性为目标，挑选黄槐复方提取道路，并在单要素试验基础上，以黄芩苷、芦丁提取搬运率和浸膏得率的归纳评分值为因变量，乙醇浓度、溶剂用量、提取时刻为影响要素，使用星点规划3要素5水平试验，进行二次多项式拟合，通过效应面法优选黄槐复方提取工艺，并测定其凝血活性。成果标明凝血酶浓度在04～16 U·mL-1与沉积圈面积呈杰出线性联系，r=0997 5；均匀加样收回率为1038%，RSD 47%；黄槐合提浸膏的沉积圈面积3881 mm2，比分提浸膏沉积圈面积大；黄槐浸膏的日用量的活性8428 U。黄槐复方的最佳提取工艺为加6倍量40%乙醇，提取3次，每次2 h，归纳评分值猜测值为9426，验证值为8834，与猜测值误差为628%，最佳提取工艺制得的中间体凝血活性较好。所树立的办法能够简洁、快速、精确地测定黄槐复方的凝血活性，可用于后续工艺的挑选以及质量操控。

[关键词]黄槐复方； 凝血活性； 纤维蛋白原平板法； 星点规划效应面法

Optimization of extraction technology from compound Huanghuai

based on coagulation activity and central composite design

response surface methodology

LI Pengcheng1， LIU Tao2*， WU Yue2， ZHANG Qian2， FU Chunmei2， LIU Cui2

（1 Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， Chengdu University， Chengdu 610052， China；

2 College of Pharmacy and Biological Engineerin， Chengdu University， Chengdu 610106， China）

[Abstract]To establish a method for the determination of coagulation activity in vitro by using fibrinogen plate method The extraction route of compound Huanghuai was optimized by selecting thrombin as the reference substance The comprehensive score of extract yield and the extraction transfer rate of baicalin and rutin was set as the dependent variable， with alcohol concentration， solvent volume and extraction time as the influence factors in central composite design for quadratic fitting， and the extraction process of compound Huanghuai was optimized by using response surface methodology The results of thrombin concentration and precipitation zone area showed a good linear relationship in 0416 U·mL-1， r=0997 5 The average recovery rate was 1038% and the RSD was 47 %. The circle of precipitation area of compound Huanghuai combined extract was 3881 mm2， which was bigger than that of fractionated extract The activity on the daily amount of compound Huanghuai extract was 8428 U； and the optimum extraction technology was as follows： alcohol concentration 40%， extracted 3 times， the liquidsolid ratio 6∶1， and extraction time 2 h The predicted value of comprehensive score was 9426 and the measured value was 8834， respectively， with a relative deviation of 628% The coagulation activity of the intermediate obtained by optimal extraction process was better So the method established in this paper was simple， fast and accurate for determination of coagulation activity of compound Huanhuai， which can be also used for the screening of followup process and quality control

[Key words]compound Huanghuai； coagulation activity； fibrinogen plate method； central composite designresponse surface methodology

崩漏是妇科常见病，当时临床使用的化学药物有缩宫素（oxytocin）和前列腺素（prostaglandins）等制剂[1]，这些药物都有程度不同的副效果。中医药医治包含产后出血在内的妇科出血症，有着悠长的前史，无显着副效果。黄槐酒为《济阴纲目》中提的传统经典方[2]。由黄芩及槐米组成，以黄酒为溶剂，以烧红的称砣为热源进行提取。方中黄芩性苦，寒。具有清热燥湿，泻火解毒，止血的成效[3]。槐米性苦，微寒，凉血止血，具有清肝泻火之功[3]。两者合用到达泻火解毒，凉血止血之功，中药复方的提取工艺道路（分提或合提）对复方药效有着重要的影响，现在研讨多以目标成分断定复方提取工艺道路，本研讨选用纤维蛋白原平板法[4]对复方提取工艺道路所得的提取物的药效进行点评，可解决目标成分不能直接反响效果的问题。鉴于文献中黄槐酒的提取溶剂为酒，而古代所用的酒含醇量为20%左右，因而，本文选用20%乙醇作为提取溶剂，别的本试验在单要素试验基础上，选用星点规划效应面法优选黄槐复方的提取工艺。

1资料

SQP Satorious电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；XFS280MB手提式压力蒸汽灭菌器（浙江新丰医疗器械有限公司）；DH系列电热恒温箱（西安禾普生物科技有限公司）；医用型洁净工作台（苏州市金净净化设备科技有限公司）；HS3120超声波清洗器（天津市恒奥科技发展有限公司）；702N Hamilton微量进样器（瑞士哈美顿博纳图斯股份公司）；P230Ⅱ型高效液相色谱仪（大连依利特剖析仪器有限公司）；DZF6050A 型真空枯燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；BS6KH 型电子天平（上海友声衡器有限公司）；FA2004 型电子剖析天平（上海良平仪器仪表有限公司出产）。

黄芩、槐米药材均购自四川省荷花池中药材商场，经成都大学刘涛研讨员鉴定为唇形科黄芩植物的枯燥根和豆科植物槐的枯燥花蕾。黄芩苷对照品（批号150725，纯度>98%，四川省维克奇生物科技有限公司）；芦丁对照品（批号150622，纯度>98%，四川省维克奇生物科技有限公司）；牛凝血酶试剂（上海经科化学科技有限公司，批号T201503）；牛血纤维蛋白原试剂（上海经科化学科技有限公司，批号F20150901）；生理盐水（四川科伦药业有限公司，批号B15042001）；黄槐合提、分提浸膏（由试验室制得，批号别离为20160302，20160303）；甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为剖析纯。

2办法与成果

21凝血活性的测定办法

211纤维蛋白原平板的制备取经灭菌的直径为10 cm的培育皿，别离参加1%琼脂溶液25 mL、03%纤维蛋白原溶液20 mL，摇匀，静置30 min使其凝结后，用打孔器打出直径为3 mm的小孔，备用[5]。

212黄槐分提与合提的浸膏制备精细称取黄芩100 g，槐米25 g，参加8倍量20%乙醇，提取3次，每次1 h，滤过，兼并提取液，减压浓缩枯燥（60 ℃，-008 MPa），即得黄槐合提浸膏；精细称取黄芩100 g，槐米25 g，别离参加8倍量20%乙醇，提取3次，每次1 h，滤过，别离兼并提取液，减压浓缩枯燥（60 ℃，-008 MPa），即得黄槐分提浸膏。

213供试品溶液的制备精细称取黄槐浸膏2份，每份1 g，置2个具塞锥形瓶中，别离参加生理盐水、纯净水各10 mL，称定质量，超声5 min，放冷，再称定质量，用相应的试剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

214溶剂的调查别离精细移取2种供试品溶液、生理鹽水、纯净水各25 μL，进行同板点样，同一板内点样2次，平行试验2次。37 ℃恒温培育17 h后测定沉积圈的面积，见表1。试验成果得到生理盐水制备的供试品沉积圈清晰可见且面积较大，空白样品无搅扰。故选用生理盐水作为供试品制备的溶剂。

22规范曲线的制作

别离精细移取04，4，8，12，16 U·mL-1凝血酶溶液25 μL，进行同板点样（点入上述纤维平

板的小孔中），共点5次， 37 ℃恒温培育17 h后测定沉积圈的面积，以凝血酶浓度为横坐标，沉积圈面积为纵坐标，得线性方程为Y=1764X+4739，r=0997 5，成果标明，凝血酶在浓度为04～16 U·mL-1与沉积圈面积呈杰出的线性联系。

23精细度试验

231同板精细度试验别离精细汲取冷藏于4 ℃的10 U·mL-1凝血酶溶液25 μL，进行同板点样（点入上述纤维平板的小孔中），共点6次，37 ℃恒温培育17 h后测定沉积圈的面积，核算RSD。成果RSD 49%，同板精细度杰出。

232异板精细度试验别离精细汲取冷藏于4 ℃的10 U·mL-1凝血酶溶液25 μL，进行异板点样（点入上述纤维平板的小孔中），共点6次，37 ℃恒温培育17 h后测定沉积圈的面积，核算RSD。成果RSD 40%，异板精细度杰出。

24重复性试验

取同一批号的黄槐合提浸膏（批号20160302）1 g，精细称定，按212项下办法，用生理盐水作为溶剂，平行制备6份供试品溶液，别离精细汲取供试品溶液25 μL，进行同板点样（点入上述纤维平板的小孔中），37 ℃恒温培育，17 h后测定沉积圈的面积，核算面积与取样量的比值，并核算RSD。成果RSD 38%，重复性杰出。

25安稳性试验

取同一批号的黄槐合提浸膏（批号20160302）1 g，精细称定，按212项下办法，用生理盐水作为溶剂，制备供试品溶液，别离于0，05，1，15，2，25 h进行同板点样（点入上述纤维平板的小孔中），每次点样量为25 μL，37 ℃恒温培育，17 h后测定沉积圈的面积，核算RSD。成果RSD 24%，安稳性杰出。

26加样收回试验

取同一批号的黄槐合提浸膏（批号20160302，活性292 U·g-1）6份，每份05 g，精细称定，别离精细汲取2 U·mL-1凝血酶溶液1 mL，按212项下办法，用生理盐水作为溶剂制备供试品溶液，别离精细汲取供试品溶液25 μL，进行同板点样（点入上述纤维平板的小孔中），37 ℃恒温培育，17 h后测定沉积圈的面积，核算加样收回率。成果均匀收回率为1038%，RSD 47%。标明本办法收回率杰出。

27黄槐复方的提取道路的挑选

依照相同的生药量别离精细称取黄槐合提浸膏1 g，黄槐分提浸膏（黄芩浸膏078 g，槐米浸膏019 g）于2个具塞锥形瓶中，精细移取生理盐水10 mL于2个锥形瓶中，称定质量，超声5 min，放冷，再称定质量，用相应的试剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，别离精细移取2种供试品溶液、生理盐水、10 U·mL-1凝血酶各25 μL，进行同板点样，同一板内点样2次，平行试验2次。37 ℃恒温培育17 h后测定沉积圈的面积。成果黄槐合提浸膏的沉积圈面积为3881 mm2，分提浸膏的沉积圈面积为3453 mm2，标明黄槐合提浸膏的凝血效果强于分提浸膏的凝血效果，因而选用合提的办法。

28混合对照品的活性规范曲线的制备及其活性测定

别离精细移取质量浓度为2016，4032，6048，8064，1008 g·L-1的混合对照品溶液及空白溶剂各25 μL，进行同板点样（点入上述纤维平板的小孔中），共点6次，37 ℃恒温培育17 h后测定沉积圈的面积，以對照品浓度为横坐标，沉积圈面积为纵坐标，得线性方程为Y=0799X+8694，r=0995 5，成果标明，黄芩苷、芦丁在总浓度为2016～10080 g·L-1与沉积圈面积呈杰出的线性联系，空白无搅扰。标明后续的提取工艺能够以黄芩苷、芦丁的提取搬运率目标进行研讨。使用黄芩苷、芦丁的含量来反映其凝血活性的巨细，测得其活性为1921 U·g-1。

29黄芩苷、芦丁的测定

291色谱条件Hypersil ODS2色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm），活动相甲醇1%冰醋酸溶液（31∶69），检测波长257 nm，进样量10 μL，见图1。

292对照品溶液的制备取黄芩苷对照品、芦丁对照品适量，精细称定，加甲醇制成每1 mL含0165 mg黄芩苷、0088 6 mg芦丁的混合对照品溶液，即得。

293黄槐复方提取液供试品溶液的制备精细量取黄槐复方提取液1 mL至25 mL量瓶中，加活动相稀释至刻度，摇匀，即得。

294线性联系调查别离制造黄芩苷、芦丁混合对照品溶液，其间芦丁质量浓度为0008 86，0044 3，0088 6，0177 2，0265 8，0310 1 g·L-1，黄芩苷质量浓度为0016 5，0082 5，0165，033，0495，0577 5 g·L-1，依照291项下色谱条件进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），黄芩苷、芦丁进样浓度为横坐标（X），制作规范曲线，得芦丁的回归方程为Y=18 211X-7928，r=0999 0，标明芦丁在 0008 86～0310 1 g·L-1进样浓度与峰面积呈杰出的线性联系；黄芩苷的回归方程为Y=12 548X+3468，r=0999 0，标明黄芩苷在0016 5～0577 5 g·L-1进样浓度与峰面积呈杰出的线性联系。

210浸膏得率的测定

精细量取黄槐复方提取液 100 mL，置已枯燥至恒重的蒸发皿中蒸干，于105 ℃枯燥 3 h，置枯燥器中冷却30 min，敏捷精细称重，核算浸膏得率。浸膏得率=浸膏质量/药材总质量×100%。

211单要素试验

2111乙醇浓度调查鉴于文献中黄槐酒的提取溶剂为酒[2]，因而，本文选用乙醇作为提取溶剂。称取黄芩50 g，槐米125 g，平行8份，别离参加8倍10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇，别离提取3 次，每次提取1 h，兼并提取液，滤过，测定其黄芩苷、芦丁提取搬运率[6]以及浸膏得率，成果按黄芩苷提取搬运率芦丁提取搬运率浸膏得率=5∶3∶2进行归纳评分核算[78]，成果见图2。成果标明，跟着乙醇浓度添加，归纳评分随之下降，30%乙醇时，归纳评分最高为9925。因而将乙醇浓度定为30%。

2112提取次数调查称取黄芩50 g，槐米125 g，平行5份，别离参加8倍30%乙醇，别离提取1，2，3，4，5次，每次提取时刻为1 h，兼并提取液，滤过，测定其黄芩苷、芦丁提取搬运率以及浸膏得率，按归纳评分核算，成果见图2。成果标明，跟着提取次数的添加，归纳评分随之先是上升后下降，当提取次数为3次时，分数最高为8831。结合工业出产的实践，一起因为提取次数为非连续变量，回归处理较困难，因而将提取次数定为3次。

2113乙醇用量调查称取黄芩50 g，槐米125 g，平行8份，别离参加6，8，10，12，16，20，24，30倍30%乙醇，提取3次，每次1 h，兼并提取液，滤过，取滤液测定其黄芩苷、芦丁提取搬运率以及浸膏得率，按归纳评分核算，成果见图2。成果标明，跟着溶剂用量的添加，归纳评分分数先是随之添加，后随之下降。当溶剂用量到达8时，分数最高为9231。因而挑选8倍的溶剂用量。

2114提取时刻调查称取黄芩50 g，槐米125 g，平行5份，别离参加8倍30%乙醇，提取3次，每次提取时刻别离为05，1，15，2，25 h，兼并提取液，滤过，测定其黄芩苷、芦丁提取搬运率以及浸膏得率，按归纳评分核算，成果见图2。成果标明，跟着提取时刻的延伸，归纳分数随之上升后又下降，当提取时刻为15 h时，归纳评分分数最高为9883，因而挑选提取时刻为15 h。

212星点规划效应面优化提取工艺

2121要素与水平的断定依据单要素试验成果，选取乙醇用量（6～10倍）、提取时刻（05～25 h）、乙醇浓度（10%～50%），提取次数为3次。依据星点规划的原理，每要素设5水平，用代码值-α，-1，0，1，α来标明（2要素规划的α=1732）。代码值所标明的实践操作物理量表见表

2。将黄芩苷的提取搬运率、芦丁的提取搬运率及浸膏得率数值进行归纳评分[911]，而本试验要求黄芩苷和芦丁的提取搬运率及浸膏得率越高越好，成果见表3。

2122模型拟合选用DesignExpertV806（1）软件，以各归纳评分值对自变量进行多元线性回归和二项式拟合。得多元线性方程：Y=64902 58+8908 56X2+0230 95X3 （r=0532 6， P<005），二项式方程：Y=221939 55-40926 90X1+17469 11X2-0170 48X3-0952 02X1X2+ 0016 187X1X3-0132 86X2X3+ 2661 15X12+1013 77X22 +0007 853 66X32（r=0780 9，P<0000 1），依据

核算软件对各项系数进行的t查验成果，删去P>05的项后，再进行二项式方程拟合，到达简化模型意图。所得方程为Y=219721 14-40002 52X1 +8908 56X2+0230 95X3 +2544 47X12（r=0749 4，P<005）。从拟合方程的相联系数可见，多元线性回归方程的相联系数较低，而多元二项式拟合方程相联系数较高，拟合效果较好。

2123效应面优化及猜测性点评依据优化后的二项式方程，运用DesignExpertV806（1）软件制作点评目标随要素改变的三维效应面图和等高线图，见图3～5。

从效应面和等高线图可知，最优区域归纳评分值>85，当X1的取值在6～8倍，X2的取值在2～25 h，X3的取值在38%～50%时，归纳评分值落在最高效应值区间。进一步通过DesignEXpertV806（1）软件猜测剖析，取得一组归纳评分响应值最大的优化条件：X1为6倍，X2为2 h，X3为40%，挑选最佳提取工艺为加6倍量40%乙醇，提取3次，每次2 h。

213驗证试验

称取黄芩50 g，槐米125 g，平行3组，按优选的提取工艺进行验证试验，并将猜测值与实测值进行误差核算，成果见表4。可知，猜测值与实测值间的误差为628%，标明选用星点规划效应面法挑选的黄槐复方提取工艺重复性好，树立的数学模型具有较好的猜测性，拟合成果合理、牢靠。

214验证工艺浸膏凝血活性测定

依照相同的生药量别离精细称取3批黄槐浸膏09 g，于3个具塞锥形瓶中，精细移取生理盐水10 mL于3个锥形瓶中，称定质量，超声5 min，放冷，再称定质量，用相应的试剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，别离精细移取3种供试品溶液、生理盐水、10 U·mL-1凝血酶各25 μL，进行同板点样，37 ℃恒温培育17 h后测定沉积圈的面积。平行试验3次。成果RSD为59%，标明星点规划效应面选出的工艺浸膏凝血活性较好，能够用于黄槐复方的提取，见表5。

3评论

现在中药复方的提取工艺优选的首要目标为目标性成分含量及其搬运率，但目标性成分含量不能直接反映中药复方的药效，纤维蛋白原平板法测定凝血活性的重复性好，精确性高，操作简略，直观，安稳，测定成果能有用反映中药复方的药效。

黄槐复方来源于明朝武之望的经典名著《济阴纲目》，临床首要用于泻火止血，妇女崩漏所造成的大出血。在预试验中，本研讨将其与宫血宁胶囊等7 个上市种类的凝血功用进行了比照研讨，研讨成果标明黄槐浸膏的日用量的活性为8428 U，罢了上市种类中最大的活性药品为断血流胶囊，其活性为7898 U，与本品活性8428 U比较，本方的活血功用较强，提示有较好的开发价值。因为本文研讨目标为复方全体凝血活性，关于复方中具凝血活性的成分有待进一步研讨。

在预试验中，黄芩苷、芦丁混合对照品显示出较好的凝血活性，呈现出较好的量效联系，标明能够以芦丁、黄芩苷的提取搬运率为目标进行后续提取精制工艺研讨。

本试验在单要素试验基础上，选用星点规划效应面法得出乙醇浓度、提取时刻、溶剂用量3个要素对黄槐复方中黄酮类成分提取百分含量的效应趋势，优化了黄槐复方的提取工艺条件。从对本次试验数据所制作的曲面图能够看出，提取时刻对调查目标影响较大，而溶剂用量和乙醇浓度对调查目标的影响较小。关于此最优工艺实测评分值约为88，不及单要素调查中最优处方评分值高，或许存在着要素间的相互效果，另一方面，本文是在考虑了实践大出产过程中节省溶剂、时刻、本钱等要素，挑选了此工艺。

在进行供试品溶剂调查研讨中发现，别离用水和生理盐水溶解浸膏，得到的2种溶液性状均未见不溶物，而空白试验标明，2种溶剂均未有沉积圈，其面积相差较大的原因，有待进一步研讨，别的，需求考虑影响试验成果的要素，包含防止高温使酶失活等相关下降酶活性的要素，统筹各种溶液混合次序、试液的制造操作、点样浓度等。通过预试验断定本文中纤维蛋白原测定的各种参数，成果标明该办法安稳，重复性较强，提示体外活性点评法可作为黄槐复方提取工艺参数优选的目标。

经查阅很多文献，发现对黄槐复方止血成效的研讨报导较少，本研讨根据纤维蛋白原平板法，树立了测定中药复方中间体的凝血活性的办法，弥补了中药复方提取工艺优选中挑选目标的缺乏，是一种易于推行的试验办法，能为今后挑选中药出产工艺道路供给参阅。

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[责任编辑孔晶晶]

[收稿日期]20160907

[基金项目]四川省千人方案项目（2013332）

[通讯作者]*刘涛，研讨员级高级工程师，研讨方向为中成药质量再点评研讨，Email：liutao0578@sinacom

[作者简介]李鹏程，硕士研讨生， Email：sigualpc@sinacom