菊花黄芩指纹图谱 培养黄芩与其对照药材的HPLC指纹图谱及近红外图谱比较研讨
赵建军高晓娟++王英华++马玲 王汉卿
[摘要] 黄芩为我国常用大宗中药材，其野生资源急剧削减，目前我国宁夏、河北、山西、甘肃等地大面积培养，供中药材商场及临床运用。该研讨旨在经过12批培养黄芩药材和黄芩对照药材的HPLC指纹图谱及近红外图谱研讨，对4个产区的培养黄芩药材进行质量点评。成果显现，12批培养黄芩药材与黄芩对照药材色谱指纹图谱和近红外图谱的类似度别离大于0.961和0.983，结合12批培养黄芩药材与黄芩对照药材共有峰面积（近红外为对应点吸收值）的配对样本t查验，均无显着差异，验证了12批培养黄芩药材与对照药材质量的共同性较高。该研讨根据色谱指纹图谱与近红外图谱，并结合配对样本t查验对剖析成果进行验证，避免了剖析中因指纹图谱类似度阈值限制不明确而引起的误判，为剖析成果供给了牢靠的根据。一起，经过对归纳性较强的2种检测手法的比较研讨，为完善中药材质量操控办法供给了新的思路。
[关键词] 黄芩； 指纹图谱； 近红外； 化学成分； 质量操控
Comparative studies on HPLC fingerprint and nearinfrared spectra of
cultivated and reference crude Scutellaria baicalensis
ZHAO Jianjun1， GAO Xiaojuan1， WANG Yinghua1，3， MA Ling3， WANG Hanqing1，2*
（1. College of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；
2. Ningxia Research Center of Modern Hui Medicine Engineering and Technology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；
3. Ningxia Institute for Drug Control， Yinchuan 750004， China）
[Abstract] Scutellaria baicalensis is a common and important medicinal plant in China， facing with reducing sharply in wild resources. To meet the needs in Chinese herbwouls medicine market and clinical application， S. baicalensis has been widely cultivated in Ningxia， Hebei， Shanxi， and Gansu et al. HPLC fingerprint and nearinfrared were studied in the research to evaluate quality difference of S. baicalensis in four districts. The results showed that the similarity of HPLC fingerprint of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb is more than 0.961， and the other is more than 0.983. On the other hand， paired sample ttest indicated there has no significant difference between the common peaks′ area of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb. It was verified that 12 cultivated S. baicalensis has highly consistency with reference crude herb. On the basis of chromatographic fingerprint and nearinfrared spectrum， the study applied paired sample ttest to verify analysis results， which could avoid erroneous judgment induced by indefinite threshold values in the similarity of chromatographic fingerprint and provide reliable basis for the analysis results. Meanwhile， it also provides a new idea for improving the quality control method of Chinese medicinal materials by comparative study about two comprehensive detection means.
[Key words] Scutellaria baicalensis； fingerprint； nearinfrared spectra； chemical composition； quality control
doi：10.4268/cjcmm20162220
黄芩Scutellaria baicalensis Georgi为唇形科黄芩属多年生草本植物[1]，其根黄芩Scutellariae Radix 为大宗中药材，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功[2]。研讨标明黄芩中黄芩素、黄芩苷等黄酮类成分是其首要药效成分[3]，具有抗炎、抗菌、抗氧化、镇痛、保肝等多种药理效果[45]。跟着药理研讨的深化，其药效价值不断得到开发，野生资源因而急剧削减，黄芩已列入Ⅲ级国家重点保护野生药材物种。为满意商场需求，自1958年以来，宁夏、河北、山西、甘肃等地开端大面积培养[6]。影响中药材质量要素是杂乱而多变的，如产地、采收期、规范、成长办法等。因而，为了全面的操控及点评中药材质量，引进指纹图谱的中药质量点评形式已成为国内外共同[7]。
色谱图谱具有重复性高、别离性能好、剖析速度快、运用规模广等长处已被广泛用于中药指纹图谱的研讨[89]。但其局限性也较为显着，任何与色谱相关试验条件的改动，都意味着全体色谱图形的变异，给中药材点评作业形成必定困难，与此一起指纹图谱的解析也是研讨的一大难点，常用的类似度比较的办法尽管便利，但人为片面判别成分较多，缺少类似度阈值的限制，缺少评判的客观规范[10]。近红外光谱剖析是一种快速、价廉、无损剖析办法，适用于固体、液体等形状，可用于药物研制、出产等出产进程的质量监控。其与化学计量学结合，已被用于农业、食物、化学和石油化工等范畴的定性和定量剖析[11]。介于近红外光谱剖析的优势，其办法对中药材质量的点评成果是否与指纹图谱办法的共同，相关研讨还少有报导。
本研讨选用HPLC测定12批不同产地培养黄芩药材和1批黄芩对照药材中黄芩苷的含量并树立色谱指纹图谱。一起，根据近红外光谱剖析技能树立黄芩药材的光谱指纹图谱，并对指纹图谱及近红外光谱进行比较剖析，判别2种剖析办法中，12批培养黄芩与对照药材相比较的质量差异。
1 资料
高效液相色谱仪（Agilent 1260 LC色谱作业站，G1313A主动进样器，G1316A柱温箱，G1311A四元泵，G1379A脱气机，G1314A紫外检测器）；AE240电子剖析天平（1/1万）；超声清洗机；Bruker MatrixF型傅利叶改换近红外光谱仪（测验条件：分辨率8 cm-1；样品累积扫描次数32 Scans；布景累积扫描次数32 Scans；光谱规模12 000～4 000 cm-1；软件为OPUS 5.5）。
黄芩苷对照品（批号110715200212，我国食物药品检定研讨院）；甲醇、乙腈为色谱纯；娃哈哈纯净水；其他试剂均为剖析纯。
试验所用的12批培养黄芩药材采自于4个产区，经王英华主任药师判定为唇形科黄芩属植物黄芩S. baicalensis，样本信息见表1。黄芩对照药材来自于我国食物药品检定研讨院。
2 办法
2.1 色谱条件
色谱柱Phenomenex Gemini C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；活动相甲醇乙腈醋酸、醋酸钠（pH 4.5）缓冲液，梯度洗脱程序见表2；流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长276 nm；进样量10 μL。
2.2 色谱对照品溶液制备
精细称量黄芩苷对照品 0.016 06 g，置于10 mL的量瓶中，加适量色谱甲醇使溶解，定容至刻度，得黄芩苷对照品储藏液。精细量取黄芩苷对照品储藏液4 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成质量浓度为0.257 g·L-1的黄芩苷对照品溶液，备用。
2.3 色谱供试品溶液制备
黄芩药材破坏，过80目筛，精细称取0.5 g，置100 mL量瓶中，参加70%甲醇100 mL，称重，室温超声提取45 min，静置，补足失重，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.4 色谱办法学调查
2.4.1 精细度试验 取13号对照药材供试品溶液，接连进样5次，以黄芩苷为规范峰，各首要色谱峰相对峰面积和相对保存时刻的RSD均小于5.0%，标明仪器精细度杰出。
2.4.2 重复性试验 取13号对照药材粉末5份，每份0.5 g，按2.3项制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样检测。5次测得的各首要色谱峰峰面积和保存时刻的RSD均小于5.0%，标明该办法重复性杰出。
2.4.3 稳定性试验 取13号对照药材供试品溶液，别离于放置0， 2， 4， 8， 12， 24 h，按2.1项色谱条件进样检测。测得各时刻段的RSD均小于5.0%，标明供试品溶液在24 h内稳定性杰出。
2.5 样品色谱测定
别离精细对照品和供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样检测，记载90 min色谱图，见图1。
2.6 样品近红外光谱测定
别离取烘干至恒重且过80目筛的黄芩药材粉末适量，在Bruker MatrixF型傅利叶改换近红外光谱仪扫描近红外光谱，测验条件：分辨率8 cm-1；样品累积扫描次数32 Scans；布景累积扫描次数32 Scans；光谱规模12 000～4 000 cm-1；软件为OPUS 5.5。每个样品平行测定6次，取平均值作为该样品的原始光谱，环境条件为温度23 ℃，湿度40%。
2.7 数据剖析
2.7.1 指纹图谱类似度剖析 选用我国药典委员会公布的中药色谱指纹图谱类似度点评（A版），以对照药材色谱峰为参照峰，对12批黄芩药材和对照药材指纹图谱进行主动匹配，并对一切的HPLC指纹图谱全谱进行类似度核算，用相关系数表征类似度。
2.7.2 近红外特征谱段相关系数剖析 选用OPUS软件对获取的各批次黄芩药材及对照药材的近红外光谱进行一阶导数+矢量归一化预处理，以对照药材近红外光谱为参阅光谱，核算各批次黄芩药材测定光谱与参阅光谱的相关系数，比较其与参阅光谱的类似程度。
2.7.3 共有峰差异显着性剖析 选用SPSS 19.0 中的配对样本t查验别离剖析各培养黄芩药材与黄芩对照药材的色谱指纹图谱和光谱指纹图谱共有峰吸收是否存在显着差异。
3 成果
3.1 黄芩苷含量测定
选用HPLC测定12批培养黄芩药材和黄芩对照药材中黄芩苷含量数据，见表1。由表1可知，对照药材中黄芩苷含量高于其他各批次药材，可是，各批次药材中黄芩苷含量均高于2015年版药典规则的含量（9.0%），阐明各产地培养黄芩均可作为合格黄芩药材运用。
3.2 培养黄芩色谱指纹图谱及类似度点评
12批黄芩药材和黄芩对照药材按2.1项制备供试品溶液后按2.3项色谱条件进行检测，记载90 min色谱图，树立了黄芩HPLC指纹图谱。色谱记载数据经Aligent作业站导出AIA.格局数据后输入中药色谱指纹图谱类似度点评软件中进行共有峰标定和类似度核算。以匹配数目为13的色谱峰为共有峰，共标定23个共有峰，见图2，各共有峰的保存时刻和峰面积见表3。由表3可知，各共有峰保存时刻的RSD均小于0.40%，阐明该办法精确、牢靠，能够用于黄芩药材的质量点评。以13号黄芩对照药材为参照谱图核算的类似度，1～12号样品与对照药材的类似度别离为0.980，0.961，0.984，0.989，0.987，0.983，0.989，0.995，0.995，0.974，0.990，0.983。由类似度核算成果可知，用于树立指 纹图谱的12批培养黄芩药材和黄芩对照药材类似度较高（0.961～0.995），阐明各产地培养黄芩与对照药材的共同度较高。
3.3 培养黄芩共有峰面积与黄芩对照药材共有峰面积差异剖析
根据表3中各样品共有峰面积值，12批培养黄芩的共有峰面积值别离与黄芩对照药材共有峰面积进行配对样本t查验，查验成果见表4。由表4可知，各批次培养黄芩药材的共有峰面积与对照药材共有峰面积无显着差异。
3.4 培养黄芩近红外光谱剖析
获取的12批培养黄芩药材及黄芩对照药材的近红外原始光谱见图3。近红外光谱常遭到光程、样品厚度、基线漂移等要素的影响，在剖析之前需求对其进行预处理。矢量归一化能够消除光程或样品厚度的影响，而导数化能够消除基线漂移等要素的影响，本研讨选用一阶导数+矢量归一化对各批培养黄芩药材近红外图谱进行预处理，预处理后图谱见图4。对预处理后的近红外图谱运用OPUS 5.5软件，以对照药材图谱为参照谱图，核算1～12号培养黄芩近红外图谱与黄芩对照药材图谱的类似度成果别离为0.991， 0.989， 0.983， 0.993， 0.993， 0.991， 0.990， 0.995， 0.994， 0.995， 0.992，
0.990。由类似度核算可知，各批次培养黄芩药材与黄芩对照药材的近红外光谱类似度较高（0.983～0.995），阐明各产地培养黄芩与对照药材在近红外光谱剖析层面上的共同度较高。
3.5 培养黄芩药材与黄芩对照药材近红外吸收差异
运用OPUS软件对各批近红外光谱进行一阶导数和矢量归一化预处理后导出各点吸收数据，别离将12批培养黄芩药材的近红外吸收数据与黄芩药材的吸收数据进行配对样本t查验，查验成果见表5。由表5可知，各批次培养黄芩药材的近红外吸收与对照药材近红外吸收无显着差异。
4 评论
常用中药指纹图谱研讨的办法与技能包括广泛，如薄层色谱法、液相色谱法、气相色谱法、近红外光谱法、X射线衍射法及核磁共振法等。其间液相色谱法是最常用的指纹图谱研讨办法。但其不足之处也较为显着[12]，如对中药这样一个杂乱系统，一起处理别离与检测两大问题，单一的别离与检测形式简单丢掉很多信息；其次因为试验条件的细小改动就会显着的影响试验成果，对重现性有较大应战，这也是很多研讨黄芩指纹图谱的文章傍边，色谱图有较大差异的原因之一。近年来，近红外光谱技能较多的运用于中药的辨别和定性、定量的剖析中。其办法快速、便利、精确、非侵入式剖析、易于完成出产进程的在线操控等长处[13]。但也有其办法的局限性，如：近红外光谱较差的特征性，导致剖析技能对化学计量学极端依靠；作为相对剖析技能，数学模型的树立需求传统剖析办法辅佐等[14]。
本研讨别离选用HPLC指纹图谱和近红外光谱对4个产区12批培养黄芩药材与其对照药材的差异进行研讨，成果标明：色谱指纹图谱与近红外光谱类似度表征中，12批培养黄芩药材与其对照药材的类似度均较高（均大于0.96）。尽管类似度均较高，但因为类似度没有客观的阈值限制，为保证所得定论的牢靠性，一起选用12批培养黄芩药材指纹图谱共有峰面积（近红外为各点吸收值）与黄芩对照药材的共有峰面积（近红外为各点吸收值）进行配对样本t查验比较其差异，成果标明12批黄芩培养药材均与黄芩对照药材的吸收无显着差异，与类似度成果共同。色谱指纹图谱、近红外光谱及配对样本t查验的归纳办法彼此验证，为终究所得成果12批培养黄芩药材与黄芩对照药材质量无显着差异，作为合格药材运用供给了牢靠的剖析根据。
本研讨初次一起用色谱指纹图谱和近红外光谱剖析培养黄芩与其对照药材的质量差异，并结合配对样本t查验对剖析成果进行验证。一方面避免了剖析中因指纹图谱类似度无阈值而引起的误判；另一方面经过多种剖析的彼此验证，为剖析成果供给了牢靠的根据，一起，为完善中药材质量操控办法供给了新的思路。
上述试验成果提出了新的考虑方向，HPLC指纹图谱与近红外光谱的共同性问题是否在某些中药材原猜中，近红外光谱能够对HPLC指纹图谱进行弥补或代替，从而在判定中药材质料契合我国药典质量规范的基础上，选用愈加经济与环境友好的试验办法，还需求进一步研讨。
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[责任修改 丁广治]