麻黄的有效成分：麻黄—杏仁药对配比与有效成分含量改变规则研讨
杨丽+李莹+王清娴+孙勇兵+刘湾+李文宏
[摘要]意图 评论不同配比麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱与苦杏仁苷多组分含量的改动规则。办法 选用U6（64）均匀规划表组织配比，选用高效液相色谱法测定麻黄-杏仁药对不同配伍份额中麻黄碱、伪麻黄碱与苦杏仁苷的含量。成果 经办法学调查，麻黄碱回归方程为y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；伪麻黄碱回归方程为y=184.95x+0.7268，R2=0.9990；苦杏仁苷回归方程为y=153.5x+2.4961，R2=0.9990；麻黄与杏仁配伍后，跟着配伍份额的改动，麻黄碱、伪麻黄碱的含量与麻黄用量、苦杏仁苷与杏仁用量之间均出现杰出的线性联系。定论 该办法简洁、精确、重现性好；麻黄-杏仁药对中有用成分的含量与用药量成正相关，而与配伍份额无显着的相关性。
[关键词]麻黄-杏仁药对；麻黄碱；伪麻黄碱；苦杏仁苷
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（b）-0004-05
[Abstract]Objective To discuss the change rule between the different compatibility of ephedra-almond drugs and the multicomponent content variation of ephedrine，pseudo-ephedrine and amygdalin.Methods The U6（64） uniform design table was selected to plan proportions，and a simultaneous quantitative HPLC method was used for determination of the content of ephedrine，pseudo-ephedrine and amygdalin in different compatibility of ephedra-almond drugs.Results The regression equation of ephedrine was y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；the regression equation of pseudo-oephedrine was y=184.95x+0.7268，R2=0.9990；the regression equation of amygdalin was y=153.5x+2.4961，R2=0.9990.After compatibility of ephedra and almond，the content of ephedrine，pseudo-ephedrine and ephedrine，amygdalin and almond showed a good linear relationship with the compatibility ratio.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible.The content of effective components of ephedra-almond drugs and dose is positive correlation，but it has no obvious correlation with compatibility proportion.
[Key words]Ephedra-almond drugs；Ephedrine；Pseudo-ephedrine；Amygdalin
麻黃辛散苦泄，有用成分首要为麻黄碱和伪麻黄碱，具有发汗、平喘、止咳、祛痰、利尿等药理效果[1-4]，临床上多用于水肿、咳喘、无汗、恶寒发热、外感风寒等症状的医治[5-6]。杏仁味苦微温，有用成分为苦杏仁苷，首要有祛痰、止咳、平喘、润肠之成效[7-8]。两药配伍运用，麻黄宣肺气，杏仁降肺气，一宣一降，相得益彰[9]。《伤寒论》中麻黄汤、大青龙汤、麻黄杏仁甘草石膏汤、麻黄加术汤、麻黄杏仁薏苡甘草汤、厚朴麻黄汤、文蛤汤等皆为麻黄杏仁合用协同定喘[10-12]。谭晓梅等[13]研讨证明了麻黄-杏仁配伍运用后的确比单用麻黄或杏仁有更好的平喘效果，一起下降苦杏仁毒性，并提出麻黄-杏仁能有用改进哮喘状况的效果机制可能与下降嗜酸性粒细胞百分数和血小板数量有关。
中医医治中，组方剂量配比的不同可能发生不同的医治效果[3，14-16]。为诠释麻黄-杏仁配伍的科学内涵，本研讨选用U6（64）均匀规划表，即对麻黄、杏仁2个要素各取6个不同的水平并规划成6种配比，选用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）一起测定不同配伍比麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱与苦杏仁苷的含量，评论不同配伍比麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷多组分含量改动规则，为进一步研讨不同配伍配比与平喘机制、效果之间的联系奠定根底。
1仪器与资料
1.1仪器
Waters 2998高效液相色谱仪（美国Waters公司）；超声波清洗器（深圳市洁康洗净电器有限公司）；台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；万分之一天平（梅特勒-托利仪器制造厂）。
1.2试药与试剂
盐酸麻黄碱对照品（国家食品药品检定研讨院，批号：171241-201508）；盐酸伪麻黄碱对照品（国家食品药品检定研讨院，批号：171237-201208）；苦杏仁苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：K01020CB14）；甲醇（山东禹王实业有限公化工公司，批号：20150629033）；磷酸（西陇化工股份有限公司，批号：140913-1）；三乙胺（西陇化工股分有限公司，批号：140222-1）；二正丁胺（国药集团化学试剂有限公司，批号：20150603）；乙腈（天津康巢科技开发有限公司，批号：20131123）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
1.3药材
经江西中医药大学药学院付小梅副教授判定，麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf.的枯燥草质茎（产地：甘肃，批号：15091069）；苦杏仁为蔷薇科植物山杏Prunusarmeniaca L.var.ansu Maxim.的枯燥老练种子（产地：河北，炒苦杏仁，批号：15021533）。
1.4麻黄-杏仁药对水煎液的制备
参照临床煎药办法，依照各配比如量精细称取药材，将称取的麻黄药材参加方药总量8倍的水，浸泡30 min，加热至欢腾，然后改用小火煎煮30 min，参加苦杏仁药材煎煮40 min，趁热过滤，量测煎液总容量，留存20 ml，余下煎液浓缩，定容至1 g生药/ml，煎液和浓缩药液冻存于-20℃备用。
2办法与成果
2.1样品中麻黄碱和伪麻黄碱的HPLC测定
2.1.1色谱条件 Phenomenex Syncrgi色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司），活动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）=1.5∶98.5，流速为1.0 ml/min；柱温25℃，检测波长210 nm，进样量10 μl。
按上述色谱条件，别离取麻黄碱-伪麻黄碱混合对照品溶液、麻黄-杏仁药对供試品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，成果如图1。
2.1.2对照品溶液的制备 精细称取对照品麻黄碱0.0162 g、伪麻黄碱0.0157 g，别离用80%甲醇适量溶解，超声5 min，置50 ml容量瓶中，定容；另取制造后等容量麻黄碱和伪麻黄碱溶液混合制成混合对照品溶液；制造得到浓度为1.62 μg/ml（麻黄碱）及1.52 μg/ml（伪麻黄碱）的混合对照品储藏液。
2.1.3供试品溶液的制备 将备用冻存煎液37℃水浴冻结，室温静置2 h，汲取1.5 ml，15 000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
2.1.4阴性溶液的制备 按“2.1.3”项下办法制备得到不含麻黄的阴性对照样品。
2.1.5规范曲线的制造 精确汲取麻黄碱、伪麻黄碱对照品储藏液1、2、4、6、8、10 ml别离置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，制得系列浓度梯度的规范曲线溶液。溶液经0.22 μm有机微孔滤膜滤往后，别离进样10 μl，按2.1.1所述色谱条件进行HPLC检测剖析，记载峰面积。以质量浓度（μg/ml，x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，制造规范曲线。麻黄碱回归方程为y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；伪麻黄碱回归方程为y=184.95x+0.7268，R2=0.9990。
2.2样品中苦杏仁苷的HPLC测定
2.2.1色谱条件 Agilent TC色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），活动相：甲醇-0.1%磷酸溶液15∶85，流速为1.0 ml/min；柱温35℃，检测波长210 nm。进样量10 μl。
按上述色谱条件，取苦杏仁苷对照品溶液、麻黄-杏仁药对供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，成果如图2。
2.2.2对照品溶液的制备 精细称取对照品苦杏苷0.0156 g，用80%甲醇适量溶解，超声5 min，置50 ml容量瓶中，定容，制造得到浓度为3.12 μg/ml的对照品储藏液。
2.2.3供试品溶液的制备 将“2.1.3”项下的备用冻存煎液37℃水浴冻结，室温静置2 h，汲取1.5 ml，15000 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜滤过，取滤液作为供试品溶液。
2.2.4阴性溶液的制备 按“2.1.3”项下办法制备得到不含苦杏仁苷的阴性对照样品。
2.2.5规范曲线的制造 精确汲取苦杏仁苷对照品储藏液1、2、4、6、8、10 ml别离置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，制得系列浓度梯度的规范曲线溶液。溶液经0.22 μm有机微孔滤膜滤往后，别离进样10 μl，按“2.2.1”项下色谱条件进行HPLC检测剖析，记载峰面积。以质量浓度（μg/ml，x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，制造规范曲线。苦杏仁苷回归方程为y=153.5x+2.4961，R2=0.9990。
2.3办法学调查
2.3.1精细度试验 别离精细汲取麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷对照品溶液各10 μl，接连进样6次，记载峰面积。成果麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷峰面积的相对规范偏差（RSD）别离为0.11%、0.09%、0.17%，标明仪器精细度杰出。
2.3.2重复性试验 依照“2.1.3”项下办法平行制备麻黄-杏仁药对供试品溶液6份，0.22 μm微孔滤膜滤过，进样10 μl，别离测定供试品溶液中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷的峰面积。成果样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷峰面积RSD别离为1.54%、1.89%、0.93%，标明本文树立的HPLC检测办法有着杰出的重复性。
2.3.3安稳性试验 取麻黄-杏仁药对供试品溶液，别离于制备后0、2、4、6、8、12、24 h后进样10 μl，记载峰面积。成果样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷峰面积RSD别离为0.78%、1.22%、1.04%，标明在24 h内供试品溶液安稳。
2.3.4加样回收率试验 依照“2.1.3”项下办法平行制备麻黄-杏仁药对供试品溶液9份，别离精细参加高、中、低3个浓度麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷对照液1 ml（每个浓度3份），按上述色谱条件对三种成分进行检测，核算回收率。成果麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷的均匀加样回收率别离为98.08%、99.78%、98.56%，RSD值别离为2.69%、1.55%、1.18%。
2.4样品测定
选用均匀规划表Un（ns）来规划试验，其间s为待调查要素，n为试验次数和水平数。即对麻黄、杏仁两个要素各取6个不同的水平并规划成6种配比进行调查，选用U6（64）表。麻黄的药典用量为1.5～10.0 g，杏仁的药典用量为4.5～9.0 g。生药总量100 g，均匀规划试验配比如案，成果如表1。
参照临床煎药办法，依照上表中各配比如量称取药材，将称取的麻黄药材参加方药总量8倍的水，浸泡30 min，加热至欢腾，然后改用小火煎煮30 min，参加苦杏仁药材煎煮40 min，趁热过滤，即得供试品溶液。供试品溶液各6份，别离进样10 μl，顺次测定样品中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷的含量，折算成1 g生药/ml的含量，成果如表2。
从表2能够看出，跟着麻黄用量的添加，麻黄碱和伪麻黄碱的含量也随之添加。别离以麻黄用药量为横坐标（x），麻黄碱或伪麻黄碱含量为纵坐标（y），得线性回归方程别离为y=0.0307x+0.2316，R2=0.9908；y=0.0397x-0.0033，R2=0.9967，标明麻黄碱和伪麻黄碱在麻黄-杏仁药对中的含量与麻黄的用量出现杰出的线性联系。
跟着杏仁用量的添加，苦杏仁苷的含量也随之添加。以杏仁用药量为横坐标（x），苦杏仁苷含量为纵坐标（y），得线性回归方程为y=0.2015x+0.9631，R2=0.9969，标明苦杏仁苷在麻黄-杏仁药对中的含量与杏仁的用量亦出现杰出的线性联系。且配伍份额的改动对麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷的含量均无显着影响。
3评论
3.1剖析办法挑选
现在文献中报导的麻黄碱和伪麻黄碱定量办法首要有HPLC[11，17-18]和气相色谱质谱联用法（GC-MS）[19-20]两种；苦杏仁苷常用的定量办法有HPLC[21]和液相色谱-四极杆飞翔时刻质谱法（UPLC-QTOF-MS/MS）[22]。剖析比较发现，HPLC、GC-MS和UPLC-QTOF-MS/MS别离用于麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷定量时，均有别离度高、安稳性好的特色，又因HPLC设备运用修理本钱较低，是现在使用最为广泛的药物剖析办法，故本研讨选用HPLC对麻黄-杏仁药对中麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷进行定量剖析。
3.2活动相调查
以不同份额的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸作为活动相调查，以甲醇-0.1%磷酸溶液（1.5∶98.5）为活动相测定麻黄碱和伪麻黄碱时，以甲醇-0.1%磷酸溶液（15∶85）为活动相时测定苦杏仁苷，峰型与别离效果均最佳。
3.3供试品溶液的挑选
为了更为精确地测定各组分含量，且与对照品有更好的可比性，本研讨对供试品溶液进行了挑选。将1 g生药/ml浓缩药液作为供试品，成果响应值相对过大；将浓缩液别离稀释5、20、40倍后作为供试品，响应值均相对欠安，且检测取样微量，考虑到稀释进程对备用冻存浓缩液微量取样也存在影响，故终究挑选未浓缩煎液作为供试样品，响应值相对较好，与对照品可比性好。测定其间各组分含量，再折算成1 g生药/ml的浓度。用该办法核算得到的含量精确牢靠，能够作为麻黄-杏仁药对质量监控办法。
3.4不同配伍比对麻黄-杏仁药对中麻黄、伪麻黄、苦杏仁苷含量的影响
试验成果可见，跟着配伍份额的改动，麻黄碱、伪麻黄碱的含量与麻黄用量（R2别离为0.9908和0.9967）、苦杏仁苷和杏仁用量之间（R2=0.9969）均出现杰出的线性联系；而配伍份额的改动对麻黄碱、伪麻黄碱和苦杏仁苷的含量均无显着影响，标明配伍份额对有用成分的含量无显着影响，成果与文献报导相一致[16]。而不同配伍比对麻黄-杏仁药对的药动学及药效学影响均有待于进一步研讨。
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（收稿日期：2016-11-10 本文修改：任 念）
[基金项目]国家自然科学基金项目（81460610）
[作者简介]杨丽（1977-），女，江西中医药大学2014级药学专业在读硕士研讨生，研讨方向：根底药学
通讯作者：李文宏（1974-），男，博士，副教授，硕士生导师，研讨方向：中药药理学