神经细胞凋亡：脑损伤后神经细胞凋亡改变及黄体酮维护效果的研讨
张于++李云++裴斐++++周洪霞++++徐胜++董伟
[摘要] 意图 调查脑损害后神经细胞凋亡改动及黄体酮的维护效果。 办法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑损害组和黄体酮医治组，大鼠脑损害模型制造是使用改善的Feeney自在落体损害设备。各组于伤后24、48、72 h选材。用免疫安排化学法调查大鼠皮质和海马CA1区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达水平改动。 成果 脑损害组的Caspase-3阳性细胞数在皮质和海马CA1区较假手术组显着添加，黄体酮医治组与脑损害组比较，Caspase-3阳性细胞数显着削减，差异有统计学含义（P<0.05）。 定论 黄体酮按捺脑损害后Caspase-3的表达可能是黄体酮脑维护效果机制之一。
[要害词] 黄体酮；脑损害；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
[中图分类号] 651.1+5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0012-03
脑损害是严重危害人类健康和要挟生命的疾病之一。脑损害后的继发性损害以往以为首要是神经细胞水肿和坏死，近年发现伤口性脑损害后存在10%～50%的细胞凋亡，并且首要存在于皮质和海马等部位。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）处于细胞凋亡进程中的要害方位，是细胞凋亡进程的终究执行者[1]，在脑损害后各种病理要素效果下，Caspase-3被激活，经过效果于底物引起细胞凋亡。对脑损害后的继发性损害，现在尚无有用的医治药物。近年研讨发现，黄体酮（progesterone，PROG）作为一种神经甾体激素，在体内、体外等多种试验中现已证明具有脑损害维护效果[2]，但PROG对脑损害后细胞凋亡的影响存在争议。本试验经过树立Feeney自在落体大鼠脑损害模型，使用免疫安排化学技能，评论PROG对大鼠脑损害后Caspase-3表达的影响，以阐明PROG对脑损害的维护效果。
1 材料与办法
1.1 试验材料及仪器
恒冷箱安排切片机，CM1900型，德国Leica公司；Olympus显微摄影设备，PM-10AD型，日本Olympus公司。PROG试剂，购自Sigma公司；Caspase-3一抗试剂，购自武汉博士德公司。
1.2 试验分组
雄性成年SD大鼠54只，购自北京维通利华试验动物技能有限公司，体重250～300 g。试验动物随机分为3组：假手术组18只、脑损害组18只、PROG医治组18只；每组又分为24、48、72 h 3个时刻点检测细胞凋亡的改动。
1.3 动物模型
选用改善的Feeney自在落体办法树立大鼠伤口性脑损害模型。麻醉选用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后切开头皮，翻开直径5 mm的骨窗，其方位在矢状缝后1.5 mm，中线旁2.5 mm处；自在落体重锤质量40 g，从25 cm 处高度自在落下形成脑损害。假手术组仅切开头皮，在相同方位开相同巨细的骨窗。PROG试剂溶解于22.5% 2-羟丙基-β-环糊精溶质中，PROG医治组伤后1、6 h腹腔打针PROG 16 mg/kg以利于快速吸收，接下来接连每天1次皮下打针。
1.4 免疫安排化学检测
别离于伤后24、48、72 h 3个时刻点，对大鼠脑安排进行甲醛灌注，并且选材固定，自视穿插后做片厚5 μm的冠状切片待用。Caspase-3免疫安排化学检测选用SP法，依照免疫安排化学法阐明书参加一抗和二抗等操作。切片在400倍光镜下调查，使用免疫安排化学CMIAS真彩色医学图画主动剖析体系进行阳性细胞计数，以5个视界的平均值代表各区计数成果。
1.5 统计学处理
数据选用SPSS 16.0软件进行统计剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，选用方差剖析，以P< 0.05为差异有统计学含义。
2 成果
假手术组罕见Caspase-3表达，脑损害组伤灶周围皮质和海马CA1区，可见很多Caspase-3阳性细胞表达；与假手术组比较，脑损害组的Caspase-3阳性细胞表达显着增高，差异有统计学含义（P<0.05）；黄体酮医治组在损害的周围皮质和伤侧海马CA1区Caspase-3表达与脑损害组比较显着削减，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。
3 评论
跟着社会的开展，脑损害患者逐年增多。发达国家的颅脑损害年发作率高达（150～250）/10万人；我国颅脑损害的年发作率为（100～200）/10万人，直接和直接经济损失高达数百亿元。脑损害能够分为原发性损害和继发性损害，原发性损害无法康复；而继发性损害经过钙超载、兴奋性神经递质的开释、脂质过氧化反响、自在基发作、炎症反响等多种要素加剧脑损害，进而影响神经功用[3-4]。其间细胞凋亡在继发性脑损害中扮演重要人物[5-6]，Caspase是细胞凋亡事情的执行者，Caspase-3的激活经过效果于DNA修正蛋白、细胞骨架蛋白等裂解，终究发作细胞凋亡。
PROG对脑损害后细胞凋亡的影响存在争议。Djebaili等[7]经过树立脑损害模型，给予PROG干涉，发现PROG可下降Caspase-3的活性。但是，Hoffman等[8]树立过敏性脑炎模型，使用TUNEL法检测细胞凋亡，成果显现PROG促进凋亡的方法；进一步有学者Garcia-Segura等[9]研讨在雌激素条件下PROG对凋亡影响的试验中，成果显现下丘脑弓状神经元细胞凋亡添加，阐明PROG对雌激素抗凋亡具有按捺效果。上述文献标明，PROG对伤口性脑损害后神经凋亡的影响是十分复杂的，在不同的模型、不同的试验条件下效果效果都不共同。本试验使用自在落体脑损害模型，研讨了PROG对凋亡的影响改动，成果发现，伤口性脑损害后24 h皮质和海马CA1区即有神经细胞凋亡，脑损害后48 h神经细胞凋亡数量到达顶峰，伤后72 h有所下降，证明了脑损害后细胞凋亡的存在。给予PROG后，发现Caspase-3阳性细胞数显着减低，提示PROG按捺伤口性脑损害后神经细胞凋亡可能是PROG脑维护效果机制之一。
有学者经过进一步研讨显现[10]，PROG可能经过多种机制完成脑维护效果，例如按捺自在基的发作、削减兴奋性神经递质的开释、削减血-脑脊液屏障通透性、减轻炎症反响、按捺脑水肿、按捺钙超载、减轻脂质过氧化反响等多种生物学效应发挥神经维护效果。PROG脑维护效果的机制没有彻底清楚，近年发现PROG神经维护的效果形式，经过膜受体效果于第二信使，改动神经元的兴奋性或活化细胞内的信号转导通路发挥非基因效应[11]，并且，PROG效果速度快，副效果小，安全性好，易于经过血-脑脊液屏障，是一种十分有远景的脑损害维护药物。
[参考文献]
[1] 姚丽峰，白莉.扁平苔藓皮损中IL-17、FoxP3和Caspase-3的表达及含义[J].中国当代医药，2014，21（5）：25-27.
[2] Deutsch ER，Espinoza TR，Atif F，et al.Progesterone′s role in neuroprotection，a review of the evidence[J].Brain Res，2013，1530：82-105.
[3] 张涛，张宇新，王振海，等.塞来昔布对重型颅脑伤口后运动功用的影响[J].中华有用确诊与医治杂志，2011，25（12）：1188-1190.
[4] 张涛，张宇新.尼美舒利对大鼠重型颅脑伤口后学习回忆功用的影响[J].四川大学学报·医学版，2011，42（4）：498-502.
[5] 杨鹏，李云，朱军，等.神经节苷酯对大鼠弥漫性脑损害后学习回忆功用的维护效果[J].中华试验外科杂志，2010， 27（6）：834.
[6] 杨鹏，李云，朱军，等.亚低温对大鼠弥漫性脑损害后海马CA1区Apaf-1蛋白表达和学习回忆功用的影响[J].中华神经医学杂志，2011，10（7）：669-672.
[7] Djebaili M，Hoffman SW，Stein DG.Allopregnanolone and progesterone decrease cell death and cognitive deficits after a contusion of the rat pre-frontal cortex[J].Neuroscience，2004，123（2）：349-359.
[8] Hoffman GE，Le WW，Murphy AZ，et al.Divergent effects of ovarian steroids on neuronal survival during experimental allergic encephalitis in Lewis rats[J].Exp Neurol，2001， 171（2）：272-284.
[9] Garcia-Segura LM，Cardona-Gomez P，Naftolin F，et al.Estradiol upregulates Bcl-2 expression in adult brain neurons[J].Neuroreport，1998，9（4）：593-597.
[10] Stein DG.Is progesterone a worthy candidate as a novel therapy for traumatic brain injury？[J].Dialogues Clin Neurosci，2011，13（3）：352-359.
[11] Cooke PS，Nanjappa MK，Yang Z，et al.Therapeutic effects of progesterone and its metabolites in traumatic brain injury may involve non-classical signaling mechanisms[J].Front Neurosci，2013，7：108-119.
（收稿日期：2014-09-12 本文修改：许俊琴）
有学者经过进一步研讨显现[10]，PROG可能经过多种机制完成脑维护效果，例如按捺自在基的发作、削减兴奋性神经递质的开释、削减血-脑脊液屏障通透性、减轻炎症反响、按捺脑水肿、按捺钙超载、减轻脂质过氧化反响等多种生物学效应发挥神经维护效果。PROG脑维护效果的机制没有彻底清楚，近年发现PROG神经维护的效果形式，经过膜受体效果于第二信使，改动神经元的兴奋性或活化细胞内的信号转导通路发挥非基因效应[11]，并且，PROG效果速度快，副效果小，安全性好，易于经过血-脑脊液屏障，是一种十分有远景的脑损害维护药物。
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（收稿日期：2014-09-12 本文修改：许俊琴）
有学者经过进一步研讨显现[10]，PROG可能经过多种机制完成脑维护效果，例如按捺自在基的发作、削减兴奋性神经递质的开释、削减血-脑脊液屏障通透性、减轻炎症反响、按捺脑水肿、按捺钙超载、减轻脂质过氧化反响等多种生物学效应发挥神经维护效果。PROG脑维护效果的机制没有彻底清楚，近年发现PROG神经维护的效果形式，经过膜受体效果于第二信使，改动神经元的兴奋性或活化细胞内的信号转导通路发挥非基因效应[11]，并且，PROG效果速度快，副效果小，安全性好，易于经过血-脑脊液屏障，是一种十分有远景的脑损害维护药物。
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（收稿日期：2014-09-12 本文修改：许俊琴）