基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶—1基因发动子区（—1607）基因多态性与肾移植后环孢素诱导牙龈增生的相关性
戴巧群+单海琴+任雨+吴寅+孙科家+叶小磊
[摘要] 意图 研讨MMP1基因单核苷酸多态（-1607）1G/2G与环孢素诱导牙龈增生（CsA-GO）发作危险的联系。 办法 以聚合酶链反响和限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）剖析办法，别离检测42例环孢素诱导牙龈增生病人和118位正常对照者MMP1（-1607）1G/2G多态的基因型；以Logistic回归模型核算不同基因型与环孢素诱导牙龈增生危险的联系。 成果 环孢素诱导牙龈增生病例组的MMP1（-1607）3种基因型频率散布与对照组无显着差异（P=0.37）。带着MMP1（-1607）2G基因型者发作环孢素诱导牙龈增生的危险比带着1G基因型者高1.38倍（95%CI=0.81～2.36，P=0.24），而1G基因型与环孢素诱导牙龈增生危险无关。 定论 MMP1基因发动子区（-1607）1G/2G单核苷酸多态性或许并非环孢素诱导牙龈增生的遗传易感要素，带着2G基因型的患者发作CsA-GO的危险有增高趋势。
[关键词] 牙龈增生；基质金属蛋白酶；基因多态性；遗传易理性
[中图分类号] R781.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）30-0152-04
环孢菌素（Cyclosporine，CsA）作为临床常见的免疫按捺剂，首要运用于器官移植后的抗宿主排异反响，在临床运用进程中可诱发药物性牙龈增生（drug-induced gingival overgrowth，DGO），由CsA诱导的牙龈增生（CsA-GO）在肾移植后患者中发病率能够高达30%～50%。牙龈增生后不只能够影响患者口腔的咀嚼以及漂亮，而且为口腔微生物的成长供给了较佳的环境，能够添加免疫功用按捺患者系统感染的危险，导致严峻并发症的发作[1]。对运用CsA患者进行牙龈增生易理性研讨，能够削减易感患者发作牙龈增生的或许性，为免疫按捺剂的运用供给辅导。
正常牙龈由上皮层和固有层构成，前者归于上皮安排，附着于牙釉质或牙骨质的外表，后者首要为结缔安排，包含细胞和细胞外基质两部分，胞外基质中含有很多的胶原纤维，约占细胞外基质的60%。牙龈安排中的胶原I首要来源于牙龈成纤维细胞，基质金属蛋白酶-1是担任I型胶原降解的首要蛋白水解酶，正常情况下，胶原I组成和降解处于平衡情况。以往不少研讨以为，CsA-GO发作或许与牙龈安排胶原代谢失衡有关，即组成-降解失衡[2]。有研讨发现，在环孢素效果下基质金属蛋白酶-1（MMP1）活性下调，牙龈结缔安排I型胶原降解受按捺，发作的胶原因无法降解而堆积[3，4]。对MMP1基因活性调理位点的研讨显现，在该基因发动子区域上游1607位点1G/2G的多态性能够直接影响MMP-1的转录活性和蛋白表达水平[5]，并与多种疾病的易理性存在相关性，如结直肠癌[6]、子宫内膜异位症[7]等。而在口腔范畴，Santos等发现种植体失利患者2G型的份额显着高于对照组[8，9]。国内外不少研讨发现[10，11]，该位点多态性与口腔鳞癌的易理性密切相关。以上研讨阐明，MMP1的活性影响到I型胶原代谢。现在，国内外没有有关于MMP1多态性与环孢素诱导的牙龈增生的研讨报导，因而，本研讨侧重评论MMP1上游发动子区域-1607位点多态性与环孢素诱导的牙龈增生的相关性。
1 材料与办法
1.1 一般材料
选取我院2011年1月～2013年12月期间服用CsA到达6个月以上的肾移植患者160例，其间男125例，女35例，年纪18～60岁，术后最长时刻6年，近3个月来未经任何牙周医治，依据是否存在牙龈增生分为牙龈增生组42例和未诱发牙龈增生组（对照组）118例，牙龈增生程度评价在Angelopoulos和Goaz等人办法基础上有所调整，即0=无牙龈增生，1分=轻度牙龈增生；牙龈边际增厚，龈袋内有小叶状颗粒增生，增生的牙龈掩盖少于1/3牙冠；2分=中度牙龈增生；增生牙龈掩盖至牙冠中部；3分=重度牙龈增生；2/3以上牙冠被增生牙龈掩盖或全附着龈均有增生[12]。评价研讨目标发现，在牙龈增生组中为（1.96±0.61），在对照组中为（0.02±0.01），差异具有统计学含义（P<0.05）。血液中环孢素浓度在增生组中为（333.0±111.8）μg/mL，对照组中为（288.8±80.1）μg/mL，差异无统计学含义（P>0.05）。
1.2 DNA提取
抽取患者前臂静脉血2 mL，以枸橼酸钠抗凝，选用北京天根TIANamp 血液基因组DNA提取试剂盒（DP318），提取外周血中白细胞DNA，办法参阅试剂盒阐明书。
1.3 基因多态性检测
MMP1基因分型：选用聚合酶链反响限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）办法对MMP1基因上游-1607区域进行扩增。MMP1（-1607）1G/2G引物规划以及办法按文献报导进行[9]。扩增含该多态位点的PCR引物序列为上游引物5′-TGAGGAAATTGTAGTTAAATCCTTAGAAAG -3′和下流引物5′-TGAGGAAATTGTAGTTAAATCCTTAGAAAGTCTT -3′。PCR反响系统设置如下。北京百泰克2×Power Taq PCR MasterMix 12.5 μL（含相关的PCR Buffer以及Taq聚合酶），上下流引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，其他用水补齐反响体积到25 μL；PCR条件为：95℃变性2 min，然后94℃30 s，53℃30 s，72℃50 s进行30个循环后，72℃延伸6 min。因为在上游引物21位中引进错配碱基CC，因而产品能用于BslI的酶切，巨细为130bp。取15μL PCR产品与限制性核酸内切酶BslI（New England BioLabs）于37℃孵育3 h。酶切产品于3.0%琼脂糖凝胶电泳分离。经过酶切后，1G/1G基因型发作的片段巨细为130bp；2G/2G发作27bp和103bp；杂合子则发作巨细别离为130bp、103bp和27bp 的3个片段。每一批PCR反响均以蒸馏水代替DNA模板作为阴性对照，并设置杂合子患者为内对照，用于判别每次酶切反响是否完全，并随机抽取10%的DNA标本对PCR产品进行测序剖析以判别办法的正确性。endprint
1.4数据及统计剖析
得到患者以及对照组不同分型基因频率后，剖析是否契合Hardy-Weinberg平衡规律。一起选用SPSS 10.0软件进行数据剖析，用χ2查验比较各基因型频率在病例组与对照组之间的差异。用比值比（oddsratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）标明带着某个基因型发作环孢素诱导牙龈增生的危险度。OR值以非条件Logistic回归核算，并经性别、年纪情况校对。
2 成果
见表1。在42个牙龈增生组中，MMP1（-1607）1G/1G、1G/2G和2G/2G这3种基因型的散布频率别离为9.5%、40.5%和50.0%，在118个正常对照中，1G/1G、1G/2G和2G/2G的散布频率别离为16.1%、41.5%和42.4%， 2个不同分组基因频率散布经Hardy-Weinberg平衡规律（H-W test）检测，显现均契合H-W 散布（P>0.05）。Pearson卡方查验标明，这三种基因型在牙龈增生和对照组中差异无统计学含义（χ2=1.99，P=0.37）。Logistic回归剖析成果标明，以MMP1（-1607）1G/1G基因型带着者为参照，带着2G基因型者罹患牙龈增生患者的OR危险为带着1G基因的1.38倍（95%CI 0.81～2.36），因而，带着2G基因的患者发作CsA-GO的危险添加，但因为CI下限为0.81并未超越1，还不足以以为2G为易感的危险要素。
3 评论
CsA-GO的发作常与牙龈下结缔安排中胞外基质的堆积有关，其构成以I型胶原为主，别的也存在3型胶原以及蛋白多糖等的积累。牙龈安排中的胶原降解首要经过基质金属蛋白酶-1和-3完成。基质金属蛋白酶宗族（MMPs）是一组锌离子或钙离子依靠酶，以无活性的酶原方式排泄后可经过纤溶酶、胰蛋白酶或其他因子影响后，剪接活化并降解1种或许多种细胞外基质成分，在细胞外基质代谢调理中起重要效果。CsA-GO的发作常与胶原代谢紊乱相关，其间MMPs活性以及表达遭到较多研讨的重视。Rutter等[13]在MMP1基因发动子区上游1607位发现一个刺进/缺失多态性，多出鸟嘌呤，使得位点区域序列变为5'-GGA-3'，该型就是2G型，而只要1个鸟嘌呤的为1G型。该位点SNP普遍存在，正常个别中3种基因型份额别离为1G/1G 30%、1G/2G 30%、2G/2G 3%～40%，在癌细胞中2G/2G型的份额可进步到63.5%，与较强的基质降解并促进癌细胞搬运密切相关。其间2G等位基因构成一个转录因子ETS的中心结合序列，研讨显现ETS-1能够进步MMP-1发动子活性到达10倍[14]，一起也发现ETS能够经过动态调理MMP1和TIMP1酶系统的平衡而影响胶原的堆积，进而参加到化疗药物诱导的肾病ECM的重塑进程[15，16]。另一方面，1G等位基因则使得MMP1转录显着下降。
因为MMP1基因发动子多态性使得MMP1的表达在不同人中存在较大的差异，因而不同的人对CsA所诱导的牙龈增生也存在易理性的差异。而且CsA能够按捺来自牙龈成纤维细胞中MMP-1的活性，且出现浓度依靠性[3]。因而，CsA能够使得MMP1的表达和活性在不同人中存在必定程度的下降，进而引起胶原无法被有用降解，引起堆积添加。本研讨显现，牙龈增生以及未增生组中MMP1上游（-1607）基因多态性基因之间的散布无显着差异，提示咱们这一位点的多态性或许和CsA-GO发病无显着联系，进一步的Logistic回归剖析显现，带着1G基因型的患者发作CsA-GO的危险为带着2G基因型患者的0.73倍，95%CI为0.42～1.24，因而阐明该位点并非发作CsA-GO的危险要素。
MMP1发动子多态性与口腔疾病的报导首要集中于与牙周炎开展的相关性，可是研讨成果存在争议，部分研讨以为，含有2G/2G的患者开展为重度缓慢牙周炎的危险远高于1G等位基因的患者。也有一些研讨显现MMP1发动子区域-1607位点多态性并非缓慢牙周炎的危险要素，在不同分组中不存在统计学差异[17]。这些成果提示因为不同研讨的种族差异、试验样本容量的差异以及试验办法的不同，使得SNP与口腔疾病如牙周炎开展中的效果研讨还处于评论阶段。因为牙龈胶原代谢还和MMP宗族中MMP3的活性有关，而MMP3和MMP1都定坐落11q22.3上，两者的散布频率和连锁不平衡性或许也影响到口腔疾病的易理性。
总归，本研讨初次在CsA-GO患者中评论了MMP1基因发动子区域位点多态性与疾病开展的相关性。依据现有样本成果剖析显现，MMP1基因发动子区的功用性单核苷酸多态（-1607） 1G/2G与环孢素诱导牙龈增生的发作无显着相关，可是带着2G等位基因的患者发作CsA-GO的危险添加。因为本研讨的样本量相对较小，还需要进一步扩展研讨目标，而且搜集更多的临床预后材料，以评论该基因其他位点多态性以及相关基因如MMP3多态性对环孢素诱导牙龈增生易理性的相关性。
[参阅文献]
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