亚甲基四氢叶酸还原酶基因检测 讨论PCR—RFLP检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发病机制的联系

姜欣　舒俊俊　舒如明

[摘要]意图 评论约束性片段长度多态性聚合酶链反响（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发病机制的联系，为子痫前期的防治供给根据。办法 选取2016年5月～2017年6月我院收治的子痫前期患者100例（病例组）、健康孕妈妈500例（对照组）作为研讨目标，进行亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性剖析、基因多态性检测，并进行血液生化目标剖析，查询基本材料，进行要素剖析。成果 病例组患者一切测序都获得成功，对照组测序成功498例。两组患者的基因型频率、等位基因频率比较，差异有统计学含义（P<0.05）。两组患者的初中及以下文化水平、有方案妊娠、有方案操控饮食与弥补养分、弥补叶酸、弥补过维生素D、养分不良等要素的例数比较，差异有统计学含义（P<0.05）。病例组患者的APPT低于对照组，Hcy高于对照组，差异有统计学含义（P<0.05）。多要素剖析选用Logistic回归剖析，成果提示，等位基因TT、弥补叶酸、孕期有方案的运动成为独立风险要素（P<0.05），TT型與Hcy、APPT存在明显相关性（P<0.05）。定论 亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子癫前期有关且存在独立效果，或许与其可进步Hcy有关。

[关键词]子痫前期；GC基因；基因多态性；发病机制

[中图分类号] R714.245 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）11（b）-0086-04

[Abstract]Objective To investigate the restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction （cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP） in testing the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism and the pathogenesis of pre eclampsia，provide the basis for the prevention and treatment of preeclampsia.Methods 100 preeclampsia （the case group） and 500 healthy pregnant women （the control group） from May 2016 to June 2017 treated in our hospital were selected as subjects to conduct polymorphism analysis of methylenetetrahydrofolate reductase gene and detect of gene polymorphism.Blood biochemical indexes were analyzed，basic data was investigated and factors were analyzed.Results All cases were successfully sequenced in the case group，and 498 cases were successfully sequenced in the control group.The genotype frequency and allele frequency of the case group were compared，and the differences were statistically significant （P<0.05）.The the number of junior high school degree and below level，planned pregnancy，planned to control diet and nutritional supplements，folic acid，vitamin D supplements，the proportion of malnutrition were compared，and the differences were statistically significant （P<0.05）.APPT in the case group was lower than that in control group，and Hcy was higher than that in control group，the differences were statistically significant （P<0.05）.Logistic regression analysis was used for multivariate analysis.The results showed that allele TT，folic acid supplementation and planned exercise during pregnancy were independent risk factors （P<0.05）.There was significant correlation between TT type and Hcy and APPT （P<0.05）.Conclusion Methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphisms are associated with preeclampsia and have independent effects，which may be related to the elevation of Hcy.endprint

[Key words]Preeclampsia；GC gene；Gene polymorphism；Pathogenesis

子痫前期是人类妊娠期特有疾病，发作率为7%～12%，我国均匀为9.4%，严重威胁母婴健康，是导致怒因逝世的主要原因之一[1]。子痫前期的病因尚未被说明，或许与遗传、免疫失衡、血管内皮丢失、纤溶系统失衡、氧化应激、胰岛素反抗等要素有关。叶酸与钙磷代谢、骨矿物化、免疫功用等要素联系密切，有报导显现其与子痫前期联系密切，叶酸缺少孕妈妈更简单呈现子痫前期[2-3]。故，有理由以为叶酸代谢相关通路的基因及其多态性或许会影响子痫前期发作风险[4-5]。本研讨选取我院收治的子痫前期100例、健康孕妈妈500例作为研讨目标，进行亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性剖析和基因多态性监测，剖析基因多态性是否起到独立效果，测验剖析基因多态性与维生素D、子痫前期之间的联系，现报导如下。

1材料与办法

1.1一般材料

选取2016年5月～2017年6月我院收治的子痫前期患者100例、健康孕妈妈500例作為研讨目标。子痫前期患者100例归入病例组，年纪（29.4±2.5）岁，孕次（1.9±0.7）次，采血周（14.4±1.2）周。健康孕妈妈500例归入对照组，年纪（29.0±3.2）岁，孕次（1.8±0.5）次，采血周（14.2±1.5）周。归入规范：①临床确诊；②年纪18～45岁；③妊娠8～12周承认并树立围生期保健卡目标；④成功临产；⑤无认知精力障碍，否热严重疾病史。扫除规范：①躯体疾病或其他急慢性疾病；②怀孕前恐惧症、强迫症等精力心理疾病；③无法阅览问卷的内容，无法合作查询。两组一般材料比较，差异无统计学含义（P>0.05），具有可比性。本研讨经我院医学道德委员会审阅及赞同，患者均知晓本研讨状况并签署知情赞同书。

1.2办法

1.2.1血样收集与其他目标剖析 采血前夜22：00禁食，次日晨起8：00采血，选用真空采血法，收集肘部静脉血5 ml，均匀分为3份。1份不进行抗凝，先进行血脂监检测，检测患者总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）等目标。一起选用问卷查询办法，在产后查询孕妈妈的孕期保健状况，包含弥补叶酸状况、维生素D弥补状况、触摸毒害物质状况等。

1.2.2基因多态性剖析 ①提取DNA：选用天根公司供给的DNA，依照说明书进行操作，监测DNA纯度，取1 μl DNA样本，选用紫外分光光度计测定DNA OD260 nm/280 nm值，在规范规模1.7～2.0内为合格的样本，可进行PCR查看，不然需求从头提取。②PCR-RFLP检测：经过dbSNP数据库断定MTHFR多态位点相关信息，挑选内切酶在线剖析软件，挑选对应约束内切酶，进行PCR-RFLP检测，MTHFR（rs4846049），引物序列F：5′-CCCCTTCAGTCACAAGTAGGTGG-3′，R：5′-CCTCC AGAGCCAGCCTGAGAC-3′，扩增片段长度177 bp。③提取凝胶中的意图DNA，进行PCR产品测序。PCR扩增条件：首要装备Superminx，混匀到反响管中，每管24 μl，参加DNA模版液1 μl。PCR反响系统总量50 μl，内含10×PCR缓冲液2.5 μl，10 mM dNTP混合液0.5 μl，50 mM MgCl2 0.8 μl，PrimerF（5 uM）1 μl，PrimerR（5 uM）=1 μl，DNA模板液1 μl，PlatinumR.Taq DNA聚合酶0.2 μl，灭菌蒸馏水补足至25 μl。PCR反响条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次，72℃终末延伸5 min，4℃保存。④PCR产品判定以及测序，2%琼脂凝胶判定，选用DNA测序仪进行测序。

1.3调查目标

比较两组GC通路上不同位点的多态性成果。剖析多要素剖析中有统计学含义位点多态性是否起到独立效果，起到独立效果的位点多态性在纠正年纪等要素后，是否与维生素D等目标存在相关性[6]。

1.4统计学办法

选用SPSS 20.0统计学软件进行数据剖析，计量材料用均数±规范差（x±s）表明，两组间比较选用t查验；计数材料选用率表明，组间比较选用χ2查验，多要素剖析选用Logistic回归剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。

2成果

2.1两组患者基因型频率、等位基因频率的比较

病例组一切测序都获得成功，溶解浓度0.10～0.25 μg/μl，DNA分子量>50 kb，对照组测序成功498例。两组的基因型频率、等位基因频率比较，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。

2.2 Logistic回归多要素剖析

2.2.1两组单要素剖析

两组的初中及以下文化水平、有方案妊娠、有方案操控饮食与弥补养分、弥补叶酸、弥补过维生素D、养分不良等要素的例数比较，差异有统计学含义（P<0.05）（表2）。

2.2.2两组患者各要素的比较

病例组APPT低于对照组、Hcy高于对照组，差异有统计学含义（P<0.05）（表3）。

将以上要素作为自变量，是赋值为2，否赋值为1，基因型频率赋值办法CC=1，CT=2，TT=3，APPT、叶酸则选用原值赋值，以是否为子痫前期作为因变量，是赋值为2，否赋值为1，选用Logistic回归进行多要素剖析。成果提示，等位基因TT[OR=1.26，95%CI（1.54～1.46），P=0.014]、弥补叶酸[OR=0.67，95%CI（0.42～1.10）]，孕期有方案的运动[OR=0.47，95%CI（0.48～1.37）]成为独立风险要素（P<0.05）。endprint

2.3 TT型与Hcy、APPT的相关性剖析

经剖析，TT型与Hcy、APPT存在明显相关性（P<0.05）（表4）。

3评论

本研讨成果提示，子痫前期是多要素一起效果的成果，与基因多态性、孕期保健状况等要素有关[7]。亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子痫前期发病存在明显相关性，且起到了独立的效果，等位基因TT[OR=1.26，95%CI（1.54～1.46），P=0.014]成为独立风险要素（P<0.05）。TT型与Hcy、APPT存在明显相关性（P<0.05）。提示，亚甲基四氢叶酸还原酶基因TT型或许对子痫前期起到促进效果，且或许与其可以举高HCY、诱导凝血功用紊乱有关[8-10]。有报导显现，亚甲基四氢叶酸还原酶变异型会导致相关通路的堵塞，使血液中的同型半胱氨酸的浓度添加，然后引起血管壁损害，诱发溶血[11]。一起还或许导致叶酸缺少，引起一系列不良反响[12]。Meta剖析也证明MTHFRC677T基因多态性与妊高症、复发性天然流程有关，提示改基因多态性或许导致不良妊娠结局发作[13-15]。

综上所述，亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与子癫前期有关且存在独立效果，或许与其可进步Hcy有关。

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（收稿日期：2017-08-28 本文修改：孟庆卿）endprint