试述染色质结构与基因转录的联系 人RAG2基因5′近端染色质结构定量差异剖析及可接近区域转录调控机制研讨
薛文宇+曾艳+韦星呈
[摘要]意图 研讨人类重组激活基因2（RAG2）5′近端染色质可接近区域调控RAG2表达的分子机制。办法 选用染色质可接近性实时聚合酶链反响（CHART-PCR）剖析RAG2基因5′近端区域的DNase Ⅰ超敏位点（DHS），比较RAG阳性和阴性淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质敞开状况改动。选用双荧光素酶陈述基因剖析DHS的转录调控活性，选用胶迁徙实验和染色质免疫沉积实验证明GATA3的体外（in vitro）和在体（in vivo）结合，选用PCR定点骤变和显性负骤变体技能证明GATA3对RAG2基因的调控效果。結果 人RAG2基因5′上游近端区域染色质在T与B细胞中处于不同的敞开状况，RAG阳性T细胞的中心启动子活性与其特异性DHS相吻合。T细胞特异性转录因子GATA3结合于T细胞特异性DHS的高度保存区域，特异性上调陈述基因及在体RAG2 mRNA在T细胞中的表达。定论 RAG2基因5′近端区域经过染色质敞开状况改动调控基因表达的特异性。GATA3与高度保存的DHS区域结合，上调内源性人RAG2在T细胞中的表达。
[要害词]重组激活基因；染色质可接近性；启动子；顺式效果元件；转录因子；T淋巴细胞
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）01（c）-0007-07
[Abstract]Objective To study molecular mechanism of the regulation of RAG2 expression regulated the human recombination activating gene 2 （RAG2） 5′proximal chromatin accessible areas.Methods To compare the open states change of chromatin of RAG positive and negative lymphocytes as well as non lymphocyte chromatin，chromatin accessibility by real-time polymerase chain reaction （CHART-PCR） was used for DNase Ⅰ analysis of RAG2 gene 5′proximal regions of hypersensitive sites （DHS）.Double luciferases reporter assay was used to examine the transcriptional regulation effects of the DHS regions.Electrophoresis mobility shift assay and chromatin immunoprecipitation assays were used to detect the binding of GATA3 in vitro or in vivo.PCR site-directed mutant assay and dominant-negative mutant assay were used to identify the regulatory effects of GATA3 on the reporter gene （in vitro），as well as on RAG2 gene （in vivo）.Results In T and B cells，the chromatin structures of 5′ proximal region of human RAG2 were in distinct open states.In RAG positive T cells，the activity of RAG2 core promoter corresponded to its specific DHS.GATA3，a T-cell specific transfactor，bound to a highly conserved sequence within the specific DHS，and increased the expression of the reporter genes as well as RAG2 mRNA of the T cells in vivo.Conclusion RAG2 gene 5′proximal area through open states change of chromatin regulate the specificity of the gene expression，GATA3 regulates the expression of endogenous RAG2 in T cells by binding to highly conserved DHS regions.
[Key words]Recombination activating gene；Chromatin accessibility；Promoter；Cis-acting element；Transcription factor；T lymphocyte
重组激活基因（recombination activating gene，RAG）编码的重组激活酶RAG1和RAG2介导抗原受体基因V（D）J重排，在抗原受体多样性细胞库的构成以及淋巴细胞分解发育进程中发挥要害效果[1]。任一RAG基因的无效骤变，将阻断T和B淋巴细胞发育，导致严峻免疫缺点病[2-3]。
在T和B细胞发育进程中，RAG1和RAG2表达具有严厉的安排、阶段特异性。以往的研讨者对调控小鼠RAG1和RAG2转录的启动子及增强子、其他类型的转录调控元件以及转录调控因子的研讨成果进行了报导[1，4-6]，还报导了小鼠RAG2启动子、淋巴细胞特异性增强子（D3）、B细胞特异性增强子（Ep）、以及转录因子的结合与调控功用研讨成果[7-10]，可是现在对人RAG转录调控机制的报导非常有限，尤其是缺少在体（in vivo）的研讨依据。
本研讨将经过CHART-PCR（chromatin accessibility by real-time PCR）办法对人RAG2基因5′近端区域的DNase Ⅰ 超敏位点（DNase Ⅰ hypersensitivity site，DHS）进行定量剖析，比较RAG阳性（RAG+）T和B淋巴细胞、RAG阴性（RAG-）淋巴细胞以及非淋巴细胞的染色质敞开状况改动；研讨T细胞中转录因子（transcription factor，TF）与DHS在体外（in vitro）和在体（in vivo）的特异性结合對陈述基因的调控效果以及TF显性负骤变体（dominant-negative mutant，DNM）对内源性RAG2表达的直接影响。
1材料与办法
1.1细胞
Reh（RAG+人pre-B细胞）由ATCC供给，Daudi（RAG-人B细胞）、CCRF-CEM（RAG+人pre-T细胞）、Jurkat（RAG+人胸腺T细胞）、Hut78（RAG-人T细胞）、K562（RAG-人红细胞系）均由中科院细胞库供给。上述细胞运用RPMI 1640（GIBCO），参加10% FCS、100 U/ml氨苄青霉素、0.1 mg/ml链霉素以及5% CO2、37℃培育。
1.2 CHART-PCR判定DHS
1.2.1 DNase I处理 办法参阅Ling等[11]的办法略作改进，1.5×107细胞核经0～2 U/μl DNase Ⅰ（TakaRa）效果，10 mmol/L Proteinase K停止反响后，提取基因组DNA。
1.2.2 CHART-PCR剖析 引物规划使扩增产品为80～250 bp的接连或部分堆叠的意图基因片段（表1）。运用Primer 3和Oligo 7.58进行引物点评，Primer-Blast做特异性剖析。基因组DNA经5倍稀释（0、0.8、4.0、20.0、100.0、500.0 ng）做规范曲线。意图DNA模板参加量为50 ng，SYBR？誖Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa），ABI 7500（applied biosystems），每个反响设3次重复。
1.3陈述基因、TF过表达及DNM表达载体
1.3.1 pGLhR2陈述基因 运用pGL4.10[Luc2]（Promega）载体，将人RAG2转录开始位点（TSS）5′上游（-1746、-789、-323、-157、-129、-108、-70、-9 bp）至+104 bp区域衔接至Sac Ⅰ/Xho Ⅰ位点。
1.3.2 pGLhR2G3m（GATA3结合位点骤变载体） 将pGLhR2-108/+104的GATA3位点骤变（TAAATC→TAAAAG）。
1.3.3 GATA3表达载体pEF1-hGATA3 将含CDS（GeneBank Accession：NM001002295）区域的2.4 kb片段从全长GATA3 cDNA克隆（GENECHEM）中切出（EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ），刺进pEF1载体（Invitrogen）的相同位点。
1.3.4 pEF1-hG3KRR（GATA3DNM表达载体） 依照Smith等[12]的办法，将GATA3锌指结构中的KRR骤变为AAA。引进KRR骤变的寡核苷酸序列为5′-CTCATTAAGCCCGCGGGCAGCGCTGTCTGCAGCC-3′和5′-GGCTGCAGACAGCGCTGCCGCGGGCTTAATG ？鄄AG-3′。各克隆经DNA测序验证。
1.4 细胞转染和TF过表达及DNM表达
1.4.1转染实验 运用DEAE（diethylaminoethyl）-葡聚糖办法和双荧光素酶（Luc2/hRLuc）陈述基因体系（Pro？鄄mega），转染功率内控运用pGL 4.74[hRLuc/TK]载体[7]。
1.4.2 TF过表达 与pGLhR2陈述基因共转染，不同剂量的GATA3表达载体用pEF1载体调理为相同的DNA总量。
1.4.3 DNM表达 转染pEF1-hKRRG3，DNA总量的调理办法同上。成果以3次实验值的均数与规范差表明。
1.5胶迁徙实验
细胞核蛋白提取办法如前所述[8]。凝胶迁徙实验（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）选用LightShift Chemiluminescent EMSA kit（PIERCE），依照kit规范流程操作。超迁徙（supershift）实验：在参加探针之前，预先将核蛋白与1 g抗人GATA3多克隆抗体（Santa Cruz）或对照IgG混合。细胞核蛋白结合竞赛实验：含有GATA3共有结合序列（consensus sequence）或骤变的GATA3结合序列的寡核苷酸序列分别为5′-GAAGTGAAAGAGTTAAATCCTGAGGGTAAC-3′和5′-GAAGTGAAAGAGTTAAAAGCTGAGGGTAAC-3′。
1.6染色质免疫沉积
染色质免疫沉积（chromatin immunoprecipitation，ChIP）实验依照Hao等[13]的办法稍作调整。将5×106 细胞用1%甲醛交联。选用超声破碎仪（SONICS）将染色质DNA开裂为200～1000 bp片段，选用Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA（Beyotime）清洗、收回DNA。参加2 g鼠抗人GATA3抗体（Santa Cruz）或对照用鼠IgG，Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA沉积，一起设未加抗体对照组用。免疫沉积物经清洗、免除交联、脱蛋白及收回DNA后，进行PCR检测。人RAG2启动子特异性引物序列为5′-TCAAGTTTTGCCCAGAT？鄄TTC-3′和5′-CCCTCAGGAT？鄄TTAACTCTTTCAC-3′。
1.7 qRT-PCR检测mRNA表达
RNAiso Plus（TaKaRa）纯化的总RNA，选用OrimeScript RT reagent kit（TaKaRa）反转录cDNA。qRT-PCR测定mRNA表达时，用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）。以人Acin为管家基因，各样品检测数据进行3～6次重复实验，经过2-ΔΔCT办法核算意图mRNA的相对表达量。
1.8 统计学处理
选用SPSS 16.0统计学软件对数据进行剖析，计量材料以x±s表明，选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1人RAG表达时，RAG2基因5′上游近端区域的染色质在T与B细胞中处于不同的敞开状况
染色质特异性敞开往往与顺式转录调控元件的存在相关[11，14]。将RAG+、RAG-淋巴细胞以及非淋巴细胞的RAG2 5′上游区域的DHS进行比较剖析，成果如图1和图2A所示，在RAG+T细胞中，RAG2 TSS/-140 bp区域对DNase Ⅰ高度灵敏（灵敏性>90%），-257 bp区域降至40%～60%，-337/-456 bp区域进一步下降至10%～20%。而-458/-695 bp区域再次升高至90%。-730 bp以上区域灵敏性消失。RAG+B细胞的敞开区更大（TSS/-257 bp），其他区域与RAG+T细胞相同，而上述区域在RAG-淋巴细胞及非淋巴细胞中均未检测到DHS，提示染色质结构水平的调控关于RAG2表达的特异性具有重要效果，人T、B细胞RAG2启动子规模显着不同，分别在TSS至-140 bp和-257 bp区域内。
2.2 RAG+T细胞的中心启动子活性与DHS相吻合
为了剖析T细胞DHS与转录调控活性的联系，本研讨进行了陈述基因转染实验（图2B）。pGLhR2陈述基因被转染于RAG+T淋巴细胞（CCRF-CEM或Jurkat），成果如图2B所示，-1746/+104 bp的转录活性由5′端删去至-157 bp未受影响，而逐渐删去至-129、-108、和-70 bp时，活性顺次显着下降，至-9 bp时彻底消失，提示在RAG+T细胞中，人RAG2启动子的中心区域为TSS/-129 bp，与T细胞特异性DHS所在区域相吻合，而-458/-695 bp的DHS对活性无影响，或许归于无核小体区域。
2.3 T细胞特异性转录因子GATA3结合于DHS中的高度保存区域
以往发现的顺式转录元件多归于生物进化进程中高度保存的同源序列[15]，因而，本研讨运用ENCODE[16]对T细胞DHS区域进行同源性剖析，成果显现DHS中的-85 bp/-77 bp在人与其他6种不同科目哺乳动物之间同源性为100%（图3A）。运用JASPAR数据库对该区域进行TF结合序列猜测，成果显现，该区域存在T细胞特异性TF GATA3的共结合序列（82-DGATWD-77）（图3B）。为研讨GATA3是否可以结合于该82/77位点，选用CCRF-CEM（RAG+人pre-T）提取的核蛋白和-96/-66探针做EMSA，成果如图3C，2个核蛋白-DNA复合体被检测出，而且都可以被过量（200倍）的-96/-66寡核苷酸竞赛掉，即两者均为核蛋白-DNA探针的特异性结合产品。其间1个复合体（C）可以被100或200倍过量的人GATA3共结合序列特异性竞赛，而GATA3结合位点骤变体（mGATA3）的竞赛效果消失。此外，抗人GATA3抗体（-GATA3）可以与复合体中的GATA3特异性结合，构成超迁徙复合体，而阴性对照抗体（IgG）无超迁徙效果，提示RAG+人T细胞表达的GATA3可以特异性结合于高度保存的-82/-77位点。
为进一步评论GATA3在染色质水平的结合，本研讨进行了Chip实验，成果如图3D所示，在RAG+T细胞（CCRF-CEM）中，抗人GATA3抗体（GATA3）而非对照IgG，可以将结合于-157/-69 bp区域的GATA3沉积，提示当人T细胞表达RAG时，GATA3特异性的结合处于敞开状况的RAG2启动子中心区域。
2.4 GATA3特异性上调RAG2在人T淋巴细胞中的表达
为探明GATA3的调控效果，本研讨运用TF结合位点骤变和TF过表达办法研讨GATA3对陈述基因中RAG2启动子活性的影响，而且运用TF共显性负骤变办法研讨GATA3对RAG2表达的直接调控效果，成果如图4A所示，将GATA3结合位点骤变（pGLhR2 G3m）后，在CCRF-CEM细胞中的Luc相对活性下降 >40%（P<0.01），而在K562非淋巴细胞无显着改动；将不同剂量的人GATA3（pEF1-hGATA3）与pGLhR2-108/-104共转染于K562细胞后，Luc相对活性随GATA3剂量的进步而逐渐上升至1.8倍以上（图4B）；将GATA3DNM转染至CCRF-CEM T细胞后，因为对野生型GATA3的竞赛效果，使RAG2 mRNA的相对表达量（与Acin管家基因比较）下调至约70%（圖4C）。上述成果提示，GTAT3的结合可以显着进步人RAG2启动子的转录活性，进而驱动内源性RAG2的表达。
3评论
RAG1至今仍未发现任何特异性转录调控元件，人们均倾向于RAG1基因的转录调控元件缺少特异性功用，而RAG2的调控元件不仅对RAG2本身，而且可以调控RAG1基因的特异性转录[17]，本研讨也是根据这一被遍及承受的推论。尽管小鼠的研讨较为深化[4-10]，但现在人类RAG表达的特异性调控机制仍不清楚，因而对其展开研讨非常必要。
真核细胞的基因组DNA以组蛋白为中心环绕构成核小体，进而包装成染色质，并经过操控调理分子与DNA的结合，在要害的细胞核生物学进程中发挥重要效果，包含基因调控、DNA修正和仿制[18]。当基因表达时，运用DNase Ⅰ酶检测其DHS，是对顺式转录调控元件进行定位的重要手法[11，14]。本研讨运用更准确的CHART-PCR技能，对人RAG2基因5′上游近端区域的DHS规模进行定量剖析。经过对不同细胞的比较剖析发现，当人RAG表达时，RAG2启动子中心区域的染色质特异性敞开，而且T与B细胞的特异性DHS区域规模差异显着，提示T和B细胞分别受不同转录调控元件操控，这一调查应该可以对往后的研讨供给有含义的学习。此外，本研讨调查到的一个风趣现象是，在表达RAG的淋巴细胞中，RAG2基因上游稍远端（-458～-695 bp）的DHS特异性呈现，该区域在T和B细胞之间没有差异，也未能证明其对T细胞转录调控功用的影响。相似的现象也在一项关于IL-12 p40启动子的研讨中被报导[19]。至于这一RAG表达特异性的无核小体区域是否参加转录调控以外的其他细胞核生物学进程，例如经过征集核蛋白分子影响基因表达特异性染色质结构改动，需要进一步研讨。
GATA3是調控T细胞分解发育的要害的转录因子之一，从胸腺中前期祖T细胞（early T lineage progenitor，ETP）连续到外周老练T细胞的终末阶段（Th2 CD4+ T细胞）均发挥重要效果[20]。值得注意的是，GATA3对TCR、TCR和TCR启动子或增强子的结合是驱动这些基因在胸腺T细胞中表达的最重要环节[21]，而此刻也正是RAG表达的顶峰阶段。尽管曾经在小鼠细胞的体外实验中证明GATA3可以结合于RAG2启动子[7]，可是关于在体（in vivo）环境下GATA3的结合及调控效果仍未说明。
本研讨从基因表达特异性染色质结构剖析下手，发现了DHS中新的GATA3结合位点，并经过同源序列剖析提醒该GATA3结合序列在人类及多种不同哺乳动物之间高度同源，提示其为严格的进化挑选进程中保留下来的重要序列。进一步的EMSA和Chip实验证明了GATA3与该位点以及染色质环境中DHS的结合，而且运用过量表达、结合位点骤变体和GATA3DNM实验证明了GATA3对人RAG2在T细胞中表达的特异性调控效果成果，因而对RAG2的T细胞特异性调控供给了开始实验材料。进一步对其他转录调控元件及TF的研讨，特别是B细胞特异性转录调控机制的研讨将在后续陈述中论述。
称谢：衷心感谢Atsushi Muraguchi教授（Toyama Medical and Pharmaceutical University，Toyama，Japan）对本研讨的指导性定见和谨慎的学术评论及批判。
[参阅文献]
[1]Lee BS，Dekker JD，Lee BK，et al.The BCL11A transcription factor directly activates RAG gene expression and V（D）J recombination[J].Mol Cell Biol，2013，33（9）：1768-1781.
[2]Mansson R，Hultquist A，Luc S，et al.Molecular evidence for hierarchical transcriptional lineage priming in fetal and adult stem cells and multipotent progenitors[J].Immunity，2007，26（4）：407-419.
[3]Abolhassani H，Wang N，Aghamohammadi A，et al.A hypomorphic recombination-activating gene 1 （RAG1） mutation resulting in a phenotype resembling common variable immunodeficiency[J].J Allergy Clin Immunol，2014，134（6）：1375-1380.
[4]Jin ZX，Kishi H，Wei XC，et al.Lymphoid enhancer-binding factor-1 binds and activates the recombination-activating geng-2 promoter together with c-Myb and Pax-5 in immature B cells[J].J Immunol，2002，169（7）：3783-3792.
[5]Hsu LY，Lauring J，Liang HE，et al.A conserved transcriptional enhancer regulates RAG gene expression in developing B cells[J].Immunity，2003，19（1）：105-117.
[6]Hao B，Naik AK，Watanabe A，et al.An anti-silencer-and SATB1-dependent chromatin hub regulates Rag1 and Rag2 gene expression during thymocyte development[J].J Exp Med，2015，212（5）：809-824.
[7]Kishi H，Wei XC，Jin ZX，et al.Lineage-specific regulation of the murine RAG-2 promoter：GATA-3 in T cells and Pax-5 in B cells[J].Blood，2000，95（12）：3845-3852.
[8]Kishi H，Jin ZX，Wei XC，et al.Cooperative binding of c-Myb and Pax-5 activates the RAG-2 promoter in immature B cells[J].Blood，2002，99（2）：576-583.
[9]Wei XC，Kishi H，Jin ZX，et al.Characterization of chromatin structure and enhancer elements for murine recombination activating gene-2[J].J Immunol，2002，169（2）：873-881.
[10]Wei XC，Dohkan J，Kishi H，et al.Characterization of the proximal enhancer elements and transcriptional regulatory factors for murine recombination activating gene-2[J].Eur J Immunol，2005，35（2）：612-621.
[11]Ling G，Waxman DJ.DNase Ⅰ digestion of isolated nulcei for genome-wide mapping of DNase hypersensitivity sites in chromatin[J].Methods Mol Biol，2013，977（1）：21-33.
[12]Smith VM，Lee PP，Szychowski S，et al.GATA-3 Dominant Negative Mutant.Functional redundancy of the T cell receptor alpha and beta enhancers[J].J Biol Chem，1995，270（4）：1515-1520.
[13]Hao B，Krangel MS.Long-distance regulation of fetal Vδ gene segment TRDV4 by the Tcrd enhancer[J].J Immunol，2011，187（5）：2484-2491.
[14]Rudolf R，Busch R，Patra AK，et al.Architecture and expression of the NFATc1 gene in lymphocytes[J].Front Immunol，2014，5（21）：1-4.
[15]Kellis M，Wold B，Snyder MP，et al.Defining functional DNA elements in the human genome[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（17）：6131-6138.
[16]Speir ML，Zweig AS，Rosenbloom KR，et al.The UCSC Genome Browser database：2016 update[J].Nucleic Acids Res，2016，44（D1）：D717-D725.
[17]Yannoutsos N，Barreto V，Misulovin Z，et al.A cis element in the recombination activating gene locus regulates gene expression by counteracting a distant silencer[J].Nat Immunol，2004，5（4）：443-450.
[18]Bell O，Tiwari VK，Thom？覿 NH，et al.Determinants and dynamics of genome accessibility[J].Nat Rev Genet，2011，12（8）：554-564.
[19]Weinmann AS，Plevy SE，Smale ST.Rapid and selective remodeling of a positioned nucleosome during the induction of IL-12 p40 transcription[J].Immunity，1999，11（6）：665-675.
[20]Naito T，Tanaka H，Naoe Y，et al.Transcriptional control of T-cell development[J].Int Immunol，2011，23（11）：1-8.
[21]Hosoya T，Maillard I，Engel JD.From the cradle to the grave：activities of GATA-3 throughout T cell development and differentiation[J].Immunol Rev，2010，238（1）：110-125.
（收稿日期：2016-12-07 本文編辑：祁海文）