苯硼酸与羟基的反响 根据苯硼酸双羟基辨认的竞赛反响对黄芪甲苷的特异性检测研讨
李成林+张琳+洪金鑫等
[摘要] 意图 立异性地提出一种可高活络、高挑选性定量检测中药材中黄芪甲苷的新办法。 办法 将氨基苯硼酸共价吸附到多孔硅胶中，制备得到苯硼酸功用化的分子印迹资料。该印迹资猜中的双羟基基团能与黄芪甲苷分子结构中的双羟基发作特异性辨认。选用紫外分光光度法为检测手法，以茜素红（ARS）为光度指示剂，使用ARS与黄芪甲苷之间的双羟基竞赛反响，调查参加不同浓度的黄芪甲苷后所引起可见光区吸光度的改动，到达高活络定量剖析黄芪甲苷的意图。 成果 在510 nm处，溶液吸光度响应值的改动与黄芪甲苷的浓度在1×10-6～6.4×10-4 mol/L内出现杰出的线性关系，线性回归系数为0.9929，检出限为0.3×10-6 mol/L。 定论 本办法成果可信，重复性较好，可用于中药材中黄芪甲苷的定量剖析。
[关键词] 黄芪甲苷；茜素红；竞赛反响；紫外分光光度法
[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（c）-0004-04
[Abstract] Objective To establish a new strategy for the sensitive and specific determination in Chinese medicinal herbs of astragaloside Ⅳ. Methods Molecular imprinting material phenylboronic acid functionalized was prepared by the adsorption of the amino phenylboronic acid covalently to porous silica gel.Specific recognition was produced between double hydroxyl groups in molecular imprinting material phenylboronic acid functionalized and two hydroxyl groups in the molecular structure of astragaloside Ⅳ.UV spectrophotometry was adopted as the mean of detection.ARS was adopted as an indicator for the photometric.The change of visible region added to different concentrations of astragaloside Ⅳ was observed to achieve objective of the high sensitive and quantitative analysis of astragaloside Ⅳ through the double hydroxyl competitive reaction between ARS and astragaloside Ⅳ. Results Under 510 nm，the absorbance displayed a linear relationship toward astragaloside Ⅳ in the concentration range from 1.0×10-6 to 6.4×10-4 mol/L with the linear regression coefficient of 0.9929 and the detection limit of 0.3×10-6 mol/L. Conclusion This method result is reliable.It has good reproducibility，can be used for quantitative analysis in Chinese medicinal herbs of astragaloside Ⅳ.
[Key words] Astragaloside Ⅳ；Alizarin Red S；Competitive reaction；UV-vis
在我国药典中，黄芪药材及含黄芪的复方中成药一般都需要对黄芪甲苷的含量进行测定。现在测定办法多为薄层扫描法[1]，香草醛硫酸比色法[2]以及高效液相色谱法[3-4]。前两种办法操作繁琐，布景搅扰多，差错较大，且后者空白吸收值高，受时刻要素搅扰较大；在高效液相色谱法测定中，黄芪甲苷分子结构中只含有一种活性基团——羟基，所以很难将其与黄芪中其他含有相同活性基团，如葡萄糖、蔗糖、芒柄花黄素等碳水化合物别离，因而，迫切需要开发一种能特异性检出黄芪甲苷的新办法。
分子印迹技能因具有预定性、辨认性、实用性三大特性，在中药活性成分的别离和纯化中发挥重要效果[5]。如张玉奎课题组将非瑟酮分子印迹聚合物作为固相萃取吸附剂，成功地对非瑟酮及其类似物槲皮素进行别离[6]。因为硼酸结构中的邻二羟基基团能挑选性辨认多糖分子，可与包含糖在内的1，2-或1，3-二羟基化合物以较高的结合功率可逆结合，然后构成安稳的酯类化合物[7-8]，因而近年来被广泛使用于多糖化合物的检测。
根据上述原理，本文立异性地提出一种可高活络、高挑选性地定量检测中药材中黄芪甲苷的新办法。笔者首先将氨基苯硼酸共价结合到多孔的硅胶结构中，并以黄芪甲苷为模板分子，制备了苯硼酸功用化的黄芪甲苷分子印迹资料；一起使用黄芪甲苷与茜素红（ARS）和氨基苯硼酸之间的竞赛反响，树立能准确辨认黄芪甲苷并高活络检出的新办法。
1 资料与办法
1.1 试剂
试验中所有试剂均为剖析纯。氨基苯硼酸、ARS、黄芪甲苷均购自上海Sigma试剂公司。PBS溶液由126.7 mmol/L氯化钠、2.7 mmol/L氯化钾、8.72 mmol/L磷酸氢二钠、1.41 mmol/L磷酸二氢钠制造而成，用浓盐酸调理至不同pH。
1.2 仪器
紫外分光光度计（UV-2450，岛津，日本），超声波清洗器（KQ218，昆山，江苏），离心机（TG20，湖南凯达）。
1.3 试验办法
1.3.1 试验原理 本试验的检测机制如图1所示。游离的ARS在510 nm处会发作显着的紫外吸收峰。试验中，将制备的苯硼酸功用化的介孔硅印迹资料浸于ARS溶液中，此刻ARS中的邻二醇结构能与苯硼酸发作共价结合效果，然后连接到印迹资料的外表，溶液中游离的ARS浓度下降，吸光值下降；当黄芪甲苷定量参加到上述混合液之后，因为黄芪甲苷具有与ARS类似的邻二醇结构，两者会发作竞赛反响，然后与外表ARS竞赛结合苯硼酸，相应地表现为溶液中ARS浓度和吸光度添加。使用黄芪甲苷参加前后所引起吸光度的改动，到达直接检测黄芪甲苷的意图。
1.3.2 氨基苯硼酸功用化硅胶印迹资料的制备 该复合资料由华东师范大学施国跃课题组友谊供给。该印迹资料以黄芪甲苷为模板分子，可挑选性辨认黄芪甲苷。
1.3.3 印迹资料与ARS的结合 别离称取1.25 mg印迹资料、1.15 mg ARS和0.24 mg黄芪甲苷，并别离溶解于1、2、5 ml的0.1 mol/L PBS（pH=7.4）溶液中，使三者的终究浓度别离为1.25、0.575、0.048 mg/ml，置于超声清洗器中超声涣散10 min。
1.3.4 UV-vis检测 别离移取50 μl 0.575 mg/ml的ARS和100 μl 1.25 mg/ml印迹资料至同一EP管中，超声涣散10 min后，室温下持续放置5 h，确保两者能彻底反响，检测溶液的紫外吸收。之后，向上述溶液中持续参加50 μl 0.048 mg/ml黄芪甲苷标准溶液，重复以上测定过程。
2 成果
3 评论
黄芪素有“补药之长”之称，具有益气固表、利尿托毒等成效，在临床上常用来医治非特异性免疫功用低下、乙型肝炎和心血管系统疾病[9]。黄芪甲苷作为中药黄芪的目标性成分使用于黄芪药材的质量监控[10-11]，现在其测定办法操作繁琐，布景搅扰多，差错较大，且特异性差[12-13]。因而，迫切需要开发一种能特异性检出黄芪甲苷的新办法。本文立异性地提出了一种可高活络、高挑选性地定量检测中药材中黄芪甲苷的新办法。以苯硼酸双羟基辨认竞赛反响为原理，经过制备氨基苯硼酸功用化的黄芪甲苷分子印迹资料，以到达对黄芪甲苷进行准确的定量。
使用紫外-可见分光光度法证明黄芪甲苷和ARS能与印迹资料外表的硼酸基团发作竞赛结合效果。图2成果所示，ARS和黄芪甲苷都能与硼酸发作共价结合效果。该混合系统中存在两个共价结合效果平衡，第一个平衡存在于硼酸与ARS之间，第二个平衡存在于硼酸与黄芪甲苷之间。因而，黄芪甲苷的参加会损坏硼酸与ARS之间的效果平衡，然后导致紫外吸收峰强度的改动。在证明该原理的基础上，又对竞赛反响的pH进行优化，并断定反响介质的最佳pH为9.0。在上述最佳试验条件下，可知在510 nm处，溶液吸光度响应值的改动与黄芪甲苷的浓度在1×10-6～6.4×10-4 mol/L内呈杰出的线性关系，线性回归系数为0.9929，检出限为0.3×10-6 mol/L。该检测办法成果可信、操作简捷、重复性较好，可用于中药材中黄芪甲苷的定量剖析。
[参考文献]
[1] 鲁静，王宝琴.黄芪甲苷的薄层扫描法测定[J].中成药，1992，14（6）：34-35.
[2] 俞家华，曹正中，张勤.膜荚黄芪中黄芪甲苷的含量测定[J].中药通报，1986，11（9）：38-39.
[3] 王改香，朱智甲，林苗，等.柱前衍生反相高效液相色谱法测定黄芪中的黄芪甲苷[J].剖析试验室，2009，28（7）：108-111.
[4] Qi LW，Yu QT，Li P，et al.Quality evaluation of Radix Astragali through a simultaneous determination of six major active isoflavonoids and four main saponins by high-performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detectors[J].J Chromatogr A，2006，1134（1-2）：162-169.
[5] 周媛媛，孟子晖，董美伶.分子印迹技能在天然产品有效成别离离纯化中的使用[J].色谱，2009，27（3）：359-363.
[6] 李礼，胡树国，何锡文，等.使用分子印迹固相萃取法提取中药活性成分非瑟酮[J].高等学校化学学报，2006，27（4）：608-611.
[7] Tong A，Yamauchi A，Hayashita T，et al.Boronic acid fluorophore/beta-cyclodextrin complex sensors for selective sugar recognition in water[J].Anal Chem，2001，73（7）：1530-1536.
[8] Salzmann CG，Llewellyn SA，Tobias G，et al.The role of carboxylated carbonaceous fragments in the functionalization and spectroscopy of a single-walled carbon-nanotube material[J].Adv Mater，2007，19（6）：883-887.
[9] Yan MM，Liu W，Fu YJ，et al.Optimization of the microwave-assisted extraction process for four main astragalosides in Radix Astragali[J].Food Chem，2010，119（4）：1663-1670.
[10] Ma XQ，Duan JA，Zhu DY，et al.Chemical comparison of Astragali Radix（Huangqi）from different ragions of China[J].Nat Med，2000，54：213-218.
[11] 徐希科，李慧梁，柳润辉，等.HPLC-ELSD法测定黄芪药材中黄芪甲苷[J].中草药，2005，36（11）：1720-1722.
[12] 林绪芳，张礼菊，邓晓辉.黄芪甲苷定量检测办法比较[J].我国药房，2007，18（21）：1670-1671.
[13] 欧燕春华.黄芪甲苷含量测定几种常用办法的比较[J].我国现代药物使用，2009，3（15）：139-141.
（收稿日期：2014-08-29 本文修改：李亚聪）
1.2 仪器
紫外分光光度计（UV-2450，岛津，日本），超声波清洗器（KQ218，昆山，江苏），离心机（TG20，湖南凯达）。
1.3 试验办法
1.3.1 试验原理 本试验的检测机制如图1所示。游离的ARS在510 nm处会发作显着的紫外吸收峰。试验中，将制备的苯硼酸功用化的介孔硅印迹资料浸于ARS溶液中，此刻ARS中的邻二醇结构能与苯硼酸发作共价结合效果，然后连接到印迹资料的外表，溶液中游离的ARS浓度下降，吸光值下降；当黄芪甲苷定量参加到上述混合液之后，因为黄芪甲苷具有与ARS类似的邻二醇结构，两者会发作竞赛反响，然后与外表ARS竞赛结合苯硼酸，相应地表现为溶液中ARS浓度和吸光度添加。使用黄芪甲苷参加前后所引起吸光度的改动，到达直接检测黄芪甲苷的意图。
1.3.2 氨基苯硼酸功用化硅胶印迹资料的制备 该复合资料由华东师范大学施国跃课题组友谊供给。该印迹资料以黄芪甲苷为模板分子，可挑选性辨认黄芪甲苷。
1.3.3 印迹资料与ARS的结合 别离称取1.25 mg印迹资料、1.15 mg ARS和0.24 mg黄芪甲苷，并别离溶解于1、2、5 ml的0.1 mol/L PBS（pH=7.4）溶液中，使三者的终究浓度别离为1.25、0.575、0.048 mg/ml，置于超声清洗器中超声涣散10 min。
1.3.4 UV-vis检测 别离移取50 μl 0.575 mg/ml的ARS和100 μl 1.25 mg/ml印迹资料至同一EP管中，超声涣散10 min后，室温下持续放置5 h，确保两者能彻底反响，检测溶液的紫外吸收。之后，向上述溶液中持续参加50 μl 0.048 mg/ml黄芪甲苷标准溶液，重复以上测定过程。
2 成果
3 评论
黄芪素有“补药之长”之称，具有益气固表、利尿托毒等成效，在临床上常用来医治非特异性免疫功用低下、乙型肝炎和心血管系统疾病[9]。黄芪甲苷作为中药黄芪的目标性成分使用于黄芪药材的质量监控[10-11]，现在其测定办法操作繁琐，布景搅扰多，差错较大，且特异性差[12-13]。因而，迫切需要开发一种能特异性检出黄芪甲苷的新办法。本文立异性地提出了一种可高活络、高挑选性地定量检测中药材中黄芪甲苷的新办法。以苯硼酸双羟基辨认竞赛反响为原理，经过制备氨基苯硼酸功用化的黄芪甲苷分子印迹资料，以到达对黄芪甲苷进行准确的定量。
使用紫外-可见分光光度法证明黄芪甲苷和ARS能与印迹资料外表的硼酸基团发作竞赛结合效果。图2成果所示，ARS和黄芪甲苷都能与硼酸发作共价结合效果。该混合系统中存在两个共价结合效果平衡，第一个平衡存在于硼酸与ARS之间，第二个平衡存在于硼酸与黄芪甲苷之间。因而，黄芪甲苷的参加会损坏硼酸与ARS之间的效果平衡，然后导致紫外吸收峰强度的改动。在证明该原理的基础上，又对竞赛反响的pH进行优化，并断定反响介质的最佳pH为9.0。在上述最佳试验条件下，可知在510 nm处，溶液吸光度响应值的改动与黄芪甲苷的浓度在1×10-6～6.4×10-4 mol/L内呈杰出的线性关系，线性回归系数为0.9929，检出限为0.3×10-6 mol/L。该检测办法成果可信、操作简捷、重复性较好，可用于中药材中黄芪甲苷的定量剖析。
[参考文献]
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[2] 俞家华，曹正中，张勤.膜荚黄芪中黄芪甲苷的含量测定[J].中药通报，1986，11（9）：38-39.
[3] 王改香，朱智甲，林苗，等.柱前衍生反相高效液相色谱法测定黄芪中的黄芪甲苷[J].剖析试验室，2009，28（7）：108-111.
[4] Qi LW，Yu QT，Li P，et al.Quality evaluation of Radix Astragali through a simultaneous determination of six major active isoflavonoids and four main saponins by high-performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detectors[J].J Chromatogr A，2006，1134（1-2）：162-169.
[5] 周媛媛，孟子晖，董美伶.分子印迹技能在天然产品有效成别离离纯化中的使用[J].色谱，2009，27（3）：359-363.
[6] 李礼，胡树国，何锡文，等.使用分子印迹固相萃取法提取中药活性成分非瑟酮[J].高等学校化学学报，2006，27（4）：608-611.
[7] Tong A，Yamauchi A，Hayashita T，et al.Boronic acid fluorophore/beta-cyclodextrin complex sensors for selective sugar recognition in water[J].Anal Chem，2001，73（7）：1530-1536.
[8] Salzmann CG，Llewellyn SA，Tobias G，et al.The role of carboxylated carbonaceous fragments in the functionalization and spectroscopy of a single-walled carbon-nanotube material[J].Adv Mater，2007，19（6）：883-887.
[9] Yan MM，Liu W，Fu YJ，et al.Optimization of the microwave-assisted extraction process for four main astragalosides in Radix Astragali[J].Food Chem，2010，119（4）：1663-1670.
[10] Ma XQ，Duan JA，Zhu DY，et al.Chemical comparison of Astragali Radix（Huangqi）from different ragions of China[J].Nat Med，2000，54：213-218.
[11] 徐希科，李慧梁，柳润辉，等.HPLC-ELSD法测定黄芪药材中黄芪甲苷[J].中草药，2005，36（11）：1720-1722.
[12] 林绪芳，张礼菊，邓晓辉.黄芪甲苷定量检测办法比较[J].我国药房，2007，18（21）：1670-1671.
[13] 欧燕春华.黄芪甲苷含量测定几种常用办法的比较[J].我国现代药物使用，2009，3（15）：139-141.
（收稿日期：2014-08-29 本文修改：李亚聪）
1.2 仪器
紫外分光光度计（UV-2450，岛津，日本），超声波清洗器（KQ218，昆山，江苏），离心机（TG20，湖南凯达）。
1.3 试验办法
1.3.1 试验原理 本试验的检测机制如图1所示。游离的ARS在510 nm处会发作显着的紫外吸收峰。试验中，将制备的苯硼酸功用化的介孔硅印迹资料浸于ARS溶液中，此刻ARS中的邻二醇结构能与苯硼酸发作共价结合效果，然后连接到印迹资料的外表，溶液中游离的ARS浓度下降，吸光值下降；当黄芪甲苷定量参加到上述混合液之后，因为黄芪甲苷具有与ARS类似的邻二醇结构，两者会发作竞赛反响，然后与外表ARS竞赛结合苯硼酸，相应地表现为溶液中ARS浓度和吸光度添加。使用黄芪甲苷参加前后所引起吸光度的改动，到达直接检测黄芪甲苷的意图。
1.3.2 氨基苯硼酸功用化硅胶印迹资料的制备 该复合资料由华东师范大学施国跃课题组友谊供给。该印迹资料以黄芪甲苷为模板分子，可挑选性辨认黄芪甲苷。
1.3.3 印迹资料与ARS的结合 别离称取1.25 mg印迹资料、1.15 mg ARS和0.24 mg黄芪甲苷，并别离溶解于1、2、5 ml的0.1 mol/L PBS（pH=7.4）溶液中，使三者的终究浓度别离为1.25、0.575、0.048 mg/ml，置于超声清洗器中超声涣散10 min。
1.3.4 UV-vis检测 别离移取50 μl 0.575 mg/ml的ARS和100 μl 1.25 mg/ml印迹资料至同一EP管中，超声涣散10 min后，室温下持续放置5 h，确保两者能彻底反响，检测溶液的紫外吸收。之后，向上述溶液中持续参加50 μl 0.048 mg/ml黄芪甲苷标准溶液，重复以上测定过程。
2 成果
3 评论
黄芪素有“补药之长”之称，具有益气固表、利尿托毒等成效，在临床上常用来医治非特异性免疫功用低下、乙型肝炎和心血管系统疾病[9]。黄芪甲苷作为中药黄芪的目标性成分使用于黄芪药材的质量监控[10-11]，现在其测定办法操作繁琐，布景搅扰多，差错较大，且特异性差[12-13]。因而，迫切需要开发一种能特异性检出黄芪甲苷的新办法。本文立异性地提出了一种可高活络、高挑选性地定量检测中药材中黄芪甲苷的新办法。以苯硼酸双羟基辨认竞赛反响为原理，经过制备氨基苯硼酸功用化的黄芪甲苷分子印迹资料，以到达对黄芪甲苷进行准确的定量。
使用紫外-可见分光光度法证明黄芪甲苷和ARS能与印迹资料外表的硼酸基团发作竞赛结合效果。图2成果所示，ARS和黄芪甲苷都能与硼酸发作共价结合效果。该混合系统中存在两个共价结合效果平衡，第一个平衡存在于硼酸与ARS之间，第二个平衡存在于硼酸与黄芪甲苷之间。因而，黄芪甲苷的参加会损坏硼酸与ARS之间的效果平衡，然后导致紫外吸收峰强度的改动。在证明该原理的基础上，又对竞赛反响的pH进行优化，并断定反响介质的最佳pH为9.0。在上述最佳试验条件下，可知在510 nm处，溶液吸光度响应值的改动与黄芪甲苷的浓度在1×10-6～6.4×10-4 mol/L内呈杰出的线性关系，线性回归系数为0.9929，检出限为0.3×10-6 mol/L。该检测办法成果可信、操作简捷、重复性较好，可用于中药材中黄芪甲苷的定量剖析。
[参考文献]
[1] 鲁静，王宝琴.黄芪甲苷的薄层扫描法测定[J].中成药，1992，14（6）：34-35.
[2] 俞家华，曹正中，张勤.膜荚黄芪中黄芪甲苷的含量测定[J].中药通报，1986，11（9）：38-39.
[3] 王改香，朱智甲，林苗，等.柱前衍生反相高效液相色谱法测定黄芪中的黄芪甲苷[J].剖析试验室，2009，28（7）：108-111.
[4] Qi LW，Yu QT，Li P，et al.Quality evaluation of Radix Astragali through a simultaneous determination of six major active isoflavonoids and four main saponins by high-performance liquid chromatography coupled with diode array and evaporative light scattering detectors[J].J Chromatogr A，2006，1134（1-2）：162-169.
[5] 周媛媛，孟子晖，董美伶.分子印迹技能在天然产品有效成别离离纯化中的使用[J].色谱，2009，27（3）：359-363.
[6] 李礼，胡树国，何锡文，等.使用分子印迹固相萃取法提取中药活性成分非瑟酮[J].高等学校化学学报，2006，27（4）：608-611.
[7] Tong A，Yamauchi A，Hayashita T，et al.Boronic acid fluorophore/beta-cyclodextrin complex sensors for selective sugar recognition in water[J].Anal Chem，2001，73（7）：1530-1536.
[8] Salzmann CG，Llewellyn SA，Tobias G，et al.The role of carboxylated carbonaceous fragments in the functionalization and spectroscopy of a single-walled carbon-nanotube material[J].Adv Mater，2007，19（6）：883-887.
[9] Yan MM，Liu W，Fu YJ，et al.Optimization of the microwave-assisted extraction process for four main astragalosides in Radix Astragali[J].Food Chem，2010，119（4）：1663-1670.
[10] Ma XQ，Duan JA，Zhu DY，et al.Chemical comparison of Astragali Radix（Huangqi）from different ragions of China[J].Nat Med，2000，54：213-218.
[11] 徐希科，李慧梁，柳润辉，等.HPLC-ELSD法测定黄芪药材中黄芪甲苷[J].中草药，2005，36（11）：1720-1722.
[12] 林绪芳，张礼菊，邓晓辉.黄芪甲苷定量检测办法比较[J].我国药房，2007，18（21）：1670-1671.
[13] 欧燕春华.黄芪甲苷含量测定几种常用办法的比较[J].我国现代药物使用，2009，3（15）：139-141.
（收稿日期：2014-08-29 本文修改：李亚聪）