芍药内酯苷芍药苷质谱 白芍中芍药苷和芍药内酯苷在大鼠血浆中含量测定及药动学研讨
曾洁+富丽萍+黄彬+张玉琴+徐伟+林羽
摘要：意图 树立測定大鼠血浆中芍药苷和芍药内酯苷含量的高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）办法，并用于研讨其在大鼠体内的药动学特征。办法 选用HPLC-MS/MS办法，色谱柱为Ultimate RXB-C18（2.1 mm×100 mm，3 ?m），活动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液（30∶70，V/V），流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 ?L，检测波长230 nm；定量离子对为：m/z 525→120.9（芍药苷和芍药内酯苷）、m/z 433→224.8（内标物栀子苷）。8只雄性SD大鼠，给予6 g原药材/kg白芍汤灌胃，别离于0、5、10、20、30、45、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶静脉取血0.5 mL，测定血药浓度，选用DAS V2.1.1药动学软件核算其首要药动学参数。成果 芍药苷和芍药内酯苷别离在40～8000 ng/mL和40～10 000 ng/mL规模内线性关系杰出（r值别离为0.999 6和0.999 5），日内和日间精细度RSD均小于6%，提取回收率别离为92.33%～95.43%和88.65%～95.62%，基质效应别离为99.29%～107.86%和93.79%～104.05%，办法学调查均契合要求。首要药动学参数：芍药苷、芍药内酯苷Cmax别离为（8.50±2.01）、（4.13±0.72）?g/mL，tmax别离为（10.00±1.73）、（20.00±2.11）min，t1/2别离为（142.98±30.11）、（127.68±35.74）min。定论 本研讨所树立的HPLC-MS/MS办法简略可行、精确牢靠、灵敏度高、专特色强，可运用于研讨与剖析芍药内酯苷和芍药苷在大鼠体内的药动学特征。
关键词：高效液相色谱-质谱联用；芍药苷；芍药内酯苷；药动学；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）02-0089-06
Study on Content Determination and Pharmacokinetics of Paeoniflorin and Paeonolide
from Paeoniae Radix Alba in Rat Plasma
ZENG Jie1， HUA Li-ping2， HUANG Bin1， ZHANG Yu-qin2， XU Wei2， LIN Yu2
1. National-Local Joint Engineering Research Center of Rehabilitation Medicine Technology of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China； 2. Pharmacy College of Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China
Abstract： Objective To establish a method for the content determination of paeoniflorin and paeonolide in rat plasma by HPLC-MS/MS； To study its characteristics of pharmacokinetics. Methods HPLC-MS/MS method was adopted. The column was Ultimate RXB-C18 （2.1 mm×100 mm， 3 ?m） with mobile phase consisted of acetonitrile- 0.1% formic acid water solution. Flow rate was 0.3 mL/min； column temperature was 30 ℃； the volume was 5 ?L； detection wavelength was 230 nm. Quantitative ions were m/z 525→120.9 （paeoniflorin and paeonolide）， m/z 433→224.8 （geniposide）. 8 SD male rats were collected blood 0.5 mL from orbital vein 0， 5， 10， 20， 30， 45， 60， 90， 120， 180， 360， 540， 720 min after intragastric administration Baishao Decoction 6 g （medicinal materials）/kg to determine the blood concentration of medicine. DAS V2.1.1 software was employed to calculate pharmacokinetic parameters. Results Good linearity was found in the range of 40–8000 ng/mL and 40–10 000 ng/mL for paeoniflorin and paeonolide （r=0.999 6， r=0.999 5）. The intra-day and inter-day RSD were less than 6%. The extraction recoveries were 92.33%–95.43% and 88.65%–95.62%. The matrix effect values were 99.29%–107.86% and 93.79%–104.05%.endprint
All items of method validation were in line with the requirements. The main pharmacokinetic parameters of paeoniflorin and paeonolide were showed as follows： Cmax of （8.50±2.01） and （4.13±0.72） ?g/mL； tmax of （10.00±1.73） and （20.00±2.11） min； t1/2 of （142.98±30.11） and （127.68±35.74） min. Conclusion The HPLC-MS/MS method established in this study is simple， feasible， accurate， reliable， highly sensitive， and specific， which can be applied to study the pharmacokinetic characteristics of paeoniflorin and paeonolide in rats in vivo.
Keywords： HPLC-MS/MS； paeoniflorin； paeonolide； pharmacokinetics； rats
白芍含有多種化学成分，具有多种药理效果，其有用部位白芍总苷被开发为胶囊制剂（产品名为帕夫林），作为抗炎免疫调节药运用于临床[1]。芍药苷和芍药内酯苷为白芍中含量较高的2个活性成分（其间芍药苷占白芍总苷的90%以上）[2]。芍药内酯苷具有抗癫痫、镇痛、解毒及止晕厥等效果[3]，芍药苷具有神经维护、生血和扩张血管等效果[4]。
有关芍药苷和芍药内酯苷的药动学研讨已有较多文献报导，但研讨首要着重于单体化合物[5-7]，以中药煎煮办法制备并调查给药后其体内药动学研讨较少。本研讨以芍药苷和芍药内酯苷为白芍代表性有用成分，树立高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）测定灌胃给药白芍煎煮液后大鼠血浆中芍药苷和芍药内酯苷含量的办法，说明其药动学特征。
1 仪器、试药与动物
Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent 6410三重四级杆质谱联用仪（美国Agilent公司），微型涡旋混合仪（其林贝尔仪器制作有限公司，VORTEX-5），高速离心机（美国贝克曼，Microfuge 22R），微量移液器（德国Eppendorf公司），十万分之一天平（METTLER TOLEDO）。
芍药苷对照品（批号110736-201033，纯度95.7%），我国食品药品检定研讨院；芍药内酯苷对照品（批号39011-90-0，纯度98%），成都曼思特生物科技有限公司；栀子苷对照品（批号110749-201127，纯度97.5%），我国食品药品检定研讨院。白芍饮片（批号20120808），福州回春中药饮片厂有限公司。乙腈（色谱纯，美国默克公司），甲酸（色谱纯，德国Merck公司），其他试剂均为剖析纯，实验用水为超纯水。
8周龄清洁级健康SD雄性大鼠24只，体质量（280±20）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002，养殖于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物房。
2 办法与成果
2.1 液相色谱及质谱条件
液相色谱条件：色谱柱为Ultimate RXB-C18（2.1 mm×100 mm，3 ?m），检测波长230 nm，活动相为乙腈-0.1%甲酸水（30∶70，V/V），等度洗脱，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 ?L。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI），枯燥气体为N2（纯度99.9%），枯燥气流量15 L/min，负离子检测形式，毛细管电压2.5 kV，离子源温度350 ℃，收集办法为多反响监测（MRM），定量离子对为m/z 525→120.9（芍药内酯苷和芍药苷）、m/z 433→224.8（内标物栀子苷）。
2.2 溶液的制备
2.2.1 白芍汤制备
称取白芍饮片，10倍量水煎煮2次，每次1.5 h，过滤，兼并2次药液，减压浓缩药液并用超纯水定容至1 g原药材/mL，供动物实验用。
2.2.2 对照品溶液及内标溶液的制备
精细称定适量对照品芍药苷和芍药内酯苷，参加甲醇，别离制得浓度为800 ?g/mL的对照品母液。另取一50 mL量瓶，移取上述对照品母液各1 mL，参加甲醇定容至刻度，即得含有16 ?g/mL芍药苷和芍药内酯苷的混合对照品贮备液。稀释得所需不同浓度的芍药苷和芍药内酯苷的混合对照品溶液。精细称定栀子苷适量，参加甲醇，定容得3 mg/mL的内标母液，稀释得浓度为30 ?g/mL的栀子苷溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱保存。
2.2.3 血浆样品的制备
大鼠随机分为给药组、对照组与空白组，每组8只。给药组大鼠实验前禁食12 h，自在饮水，按6 g/（kg·d）剂量灌胃给药；对照组和空白组给予等剂量生理盐水灌胃。给药组大鼠于灌胃后5、10、20、30、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶静脉取血0.5 mL并当即移入经肝素处理的离心试管中，静置5 min，4000 r/min离心10 min，别离取血浆，置于-20 ℃冰箱中保存待测。对照组与空白组大鼠于灌胃后5 min取血，离心后有空白血浆，置于-20 ℃冰箱中保存备用。
各组别离取50 ?L血浆，加50 ?L内标物（30 ?g/mL栀子苷甲醇溶液），给药组和空白组参加100 ?L纯甲醇，对照组别离参加“2.2.1”项下不同浓度的混合对照品溶液100 ?L（配制成不同浓度芍药内酯苷、芍药苷的血浆质控样品），涡旋2 min，以12 000 r/min离心10 min沉积蛋白后，取上清液150 ?L，放入1.5 mL EP管内，减压离心浓缩仪浓缩，温度调至45 ℃左右。挥干后，各组样品用150 ?L纯甲醇复溶，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）15 min，17 000 r/min离心10 min，移出100 ?L于全回收进样瓶中，供HPLC-MS/MS剖析。endprint
2.3 办法学验证
2.3.1 专特色实验
别离取空白组、对照组和给药组血浆样品（给药后10 h），进样测定，HPLC-MS/MS图见图1，标明血浆中的内源性物质不搅扰测定。
2.3.2 线性规模调查与最低定量限
取对照组大鼠血浆，按“2.2.3”项下办法配制成相当于芍药苷、芍药内酯苷血浆浓度为0.04、0.08、1、2、4、8 ?g/mL的血浆样品，进样5 ?L，记载色谱图。别离以芍药内酯苷、芍药苷的待测血浆浓度为横坐标，以待测峰面积与内标物质的峰面积比值为纵坐标，选用加权最小二乘法求得直线回归方程，并核算最低定量限，成果见表1。
2.3.3 精细度和规范曲线精确度实验
取沉积蛋白后的空白组大鼠血浆50 ?L，别离制备芍药苷、芍药内酯苷低、中、高3个浓度的质量操控（quality control，QC）样品和随行的规范曲线，按“2.2.3”项下办法操作，进样5 ?L，记载色谱图。每批每个浓度平行制备6份样品，分3 d重复测定3批，并与规范曲线一起进行。用随行的规范曲线核算各QC样品的浓度，经方差剖析求得本法的精细度；并用QC样品浓度的测定值与理论值的百分比标明精确度，成果见表2。成果标明，所树立的测定血浆中芍药苷、芍药内酯苷浓度的剖析办法契合要求，可用于体内测定。
2.3.4 穩定性实验
取空白组大鼠血浆，沉积蛋白后，汲取上清液，制备得芍药苷和芍药内酯苷浓度为0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3个浓度的QC样品，每个浓度样品平行制备6份，别离在室温文4 ℃环境下放置24 h、重复冻融3次（-80 ℃冷冻，室温冻结），调查样品的稳定性，之后按“2.2.3”项下办法操作，进样测定峰面积，与当日所制备规范曲线核算值之比为成果，见表3。成果标明，芍药苷和芍药内酯苷在上述环境下RSD均小于6%，稳定性杰出。
2.3.5 提取回收率及基质效应
取经沉积蛋白后的空白组大鼠血浆150 ?L，参加等体积不同浓度的芍药苷和芍药内酯苷混合对照品溶液，按“2.2.3”项下办法操作，挥干后150 ?L甲醇复溶、离心，制成浓度别离为0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3个浓度的QC样品，每个浓度平行制备6份样品，进样，得峰面积A，相同质量浓度的对照品溶液进样测定得峰面积B。基质效应（%）=（A/B）×100%。取对照组大鼠血浆，按“2.2.3”项下办法制备芍药苷和芍药内酯苷浓度为0.1、2、8 ?g/mL的低、中、高3个浓度的QC样品，进样测定，得峰面积C。提取回收率（%）=（C/A）×100%。成果见表4。成果标明，芍药苷和芍药内酯苷不存在显着的基质效应（芍药苷为93.79%～104.05%，芍药内酯苷为99.29%～107.86%，RSD均小于9%），提取回收率契合要求（芍药苷为88.65%～95.62%，芍药内酯苷为92.33%～95.43 %，RSD均小于12%）。
2.4 大鼠体内药动学研讨
SD雄性大鼠8只，灌胃给药前禁食12 h，自在饮水。按6 g/（kg·d）剂量灌胃给药，灌胃后5、10、20、30、60、90、120、180、360、540、720 min眼眶静脉取血0.5 mL，收集大鼠血浆，用经办法学验证的HPLC-MS/MS办法定量剖析血浆中芍药苷和芍药内酯苷的浓度，制作血药浓度-时刻曲线，成果见图2、图3。选用DAS V2.1.1药动学软件核算其首要药动学参数，成果见表5。芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的血药浓度达峰时刻tmax别离为10.00、20.00 min，半衰期t1/2z别离为142.98、127.68 min。标明芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的吸收和消除速率均较快。
3 评论
本研讨旨在讨论芍药苷和芍药内酯苷这2种白芍专属化学成分在大鼠体内的药动学性质，精确论述这2种目标成分的体内代谢进程，从而为白芍的进一步临床运用供给实验根据。为了愈加挨近传统中药丹方的用药习气，本实验选用煎煮法对白芍饮片进行提取，提取溶剂挑选水，并用搅扰杂质更少的超纯水替代一般用水。
血浆样品前处理中，挑选去除血浆蛋白办法时，因为芍药苷和芍药内酯苷同为水溶性物质，极性较大，因而，假如选用液-液萃取的办法除掉蛋白，芍药苷和芍药内酯苷的提取率较低。因为眼眶静脉取血单次取血量少（0.5 mL），故不适合运用固相萃取柱净化法去除血浆蛋白。终究，本研讨选用操作简略的有机溶剂沉积法，别离调查了甲醇和乙腈2种蛋白沉积剂，成果标明，甲醇较乙腈更能均匀去除血浆蛋白，色谱呼应较高，因而选用甲醇沉积血浆蛋白。
挑选活动相和质谱条件时，因为芍药苷与芍药内酯苷的母离子和子离子彻底相同，假如色谱上未能彻底别离，则会影响后续的质谱检测，因而，本研讨对液相色谱中活动相进行了调查。经比照发现，甲醇系统别离度较乙腈系统差，而且存在色谱峰拖尾形成的不对称问题，参加必定量的甲酸能够改进其峰形。因而，终究挑选乙腈-0.1%甲醇作为活动相，其别离度较甲醇系统好，质谱呼应也显着优于乙腈-水系统。针对芍药苷和芍药内酯苷的化学结构和理化性质，负离子检测形式更能进步化合物的呼应，此外再选用MRM形式。因为四级杆质谱分子量误差一般较大，故本研讨经过对所剖析化合物的磕碰裂解碎片估测剖析，选用Masslynx V4.1的精确分子量东西核算，终究断定待测物的质谱条件。
大鼠灌胃给药白芍汤后，芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内的消除进程均归于一级消除，药动学模型契合二室模型要求。调查其药动学参数可知，芍药苷和芍药内酯苷的表观散布容积/肯定生物利费用（Vz/F）均大于SD大鼠体液体积（0.6～0.7 L/kg），这与弱碱性药物散布容积较大的特色共同。芍药苷的tmax为（10.00±1.73）min，t1/2为（142.98±30.11）min；芍药内酯苷的tmax为（20.00±2.11）min，t1/2为（127.68±35.74）min。标明芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内能够被敏捷吸收，到达峰浓度后也能够敏捷消除。白芍汤灌胃给药吸收速度快，一起吸收程度较低，提示芍药苷和芍药内酯苷或许首要经上消化道吸收，对白芍相关制剂的开发和给药途径的挑选具有必定的指导意义。与同类型文献比较，其达峰时刻较快、结尾消除半衰期则有所延伸[8-10]，这种差异或许是由灌胃剂量的不同或药物的配伍效果引起的；但与一些复方制剂的药动学研讨[11-12]比较，发现白芍与其他中药配伍（如当归、甘草）能够明显添加芍药苷和芍药内酯苷的达峰时刻以及结尾消除半衰期，延伸其在体内的停留时刻。别的，本研讨中，芍药苷和芍药内酯苷的药物浓度-时刻曲线均呈现双峰现象。导致双峰的原因许多，如肝肠循环和其他循环进程（胃-肠循环、肠-肠循环等）或许胃排空推迟、药物在肠段不同部位吸收的差异等。关于芍药苷、芍药内酯苷呈现双峰的详细原因需求进一步研讨。endprint
本研讨树立了一起检测大鼠血浆中芍药苷和芍药内酯苷的HPLC-MS/MS办法，该办法灵敏度高、专特色强、精确牢靠，可运用于研讨与剖析芍药内酯苷和芍药苷在大鼠体内的药动学特征，具有较好的临床运用价值。
称谢：本课题在福建中医药大學恢复技能协同立异中心和国家中医药管理局中医恢复研讨中心赞助下完结。
参考文献：
[1] 刘怡，邓昊.帕夫林胶囊联合甲氨蝶呤医治枯燥综合征的临床剖析[J].中华全科医学，2016，14（2）：230-231，278.
[2] XIONG S， WANG Y. Simultaneous determination of paeoniflorin from total glucosides of paeony in Sprague-Dawley rats and spontaneously hypertensive rats by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry：in vivo and in vitro studies[J]. Biomed Chromatogr，2016，30（11）：1766-1771.
[3] JIANG D， CHEN Y， HOU X， et al. Influence of Paeonia lactiflora roots extract on cAMP-phosphodiesterase activity and related anti-inflammatory action[J]. J Ethnopharmacol，2011，137（1）：914- 920.
[4] 胡增峣，徐岚，闫蓉，等.芍药苷效果于神经系统的研讨进展[J].我国中药杂志，2013，38（3）：297-301.
[5] JIANG F， ZHAO Y， WANG J， et al. Comparative pharmacokinetic study of paeoniflorin and albiflorin after oral administration of Radix Paeoniae Rubra in normal rats and the acute cholestasis hepatitis rats[J]. Fitoterapia，2012，83（2）：415-421.
[6] YAN Y， CHAI C Z， WANG D W， et al. Simultaneous determination of puerarin， daidzin， daidzein， paeoniflorin， albiflorin， liquiritin and liquiritigenin in rat plasma and its application to a pharmacokinetic study of Ge-Gen Decoction by a liquid chromatography-electrospray ionization-tandem ma[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis，2014，95（3）：76.
[7] GONG C， YANG H， WEI H， et al. Pharmacokinetic comparisons by UPLC-MS/MS of isomer paeoniflorin and albiflorin after oral administration decoctions of single-herb Radix Paeoniae Alba and Zengmian Yiliu prescription to rats[J]. Biomed Chromatogr，2015， 29（3）：416-424.
[8] FEI F， YANG H， PENG Y， et al. Sensitive analysis and pharmacokinetic study of the isomers paeoniflorin and albiflorin after oral administration of Total Glucosides Of White Paeony Capsule in rats[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2016，1022：30-37.
[9] FENG C， LIU M， SHI X， et al. Pharmacokinetic properties of paeoniflorin， albiflorin and oxypaeoniflorin after oral gavage of extracts of Radix Paeoniae Rubra and Radix Paeoniae Alba in rats[J]. J Ethnopharmacol，2010，130（2）：407-413.
[10] LI T X， HU L， ZHANG M M， et al. A sensitive UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of eleven bioactive components of Tong-Xie-Yao-Fang decoction in rat biological matrices[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2014，944：90-100.
[11] LUO N， LI Z， QIAN D， et al. Simultaneous determination of bioactive components of Radix Angelicae Sinensis-Radix Paeoniae Alba herb couple in rat plasma and tissues by UPLC-MS/MS and its application to pharmacokinetics and tissue distribution[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2014，963：29-39.
[12] WANG Y， XU C， WANG P， et al. Pharmacokinetic comparisons of different combinations of Shaoyao-Gancao-Decoction in rats： simultaneous determination of ten active constituents by HPLC-MS/MS[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2013，932：76-87.endprint