乙肝带着45岁大都自愈 抗Ⅳ型胶原荧光抗体的制备及性质研讨

吴鹏等

[摘要] 意图 选用异硫氰酸荧光素标识Ⅳ型胶原单克隆抗体，为直接或直接荧光办法检测人体肝脏或血液中Ⅳ型胶原含量奠定根底。 办法 选用直接透析办法进行荧光素标识，标识后经过Sephadex G25凝胶过滤，除掉剩余的荧光素和其他杂质，取得标识荧光抗体纯品。经SDS-PAGE和双向免疫分散凝胶电泳，对标识抗体进行纯度，荧光特性，抗体特异性进行检测判定。 成果 经全自动化学发光荧光图画剖析仪检测SDS-PAGE电泳成果，激起波490nm，发射波510nm，在150KD处有一条黄绿荧光带，其他处未见条带呈现，凝胶图画剖析仪检测纯度达96%；免疫琼脂双向分散电泳成果显现，标识抗体与未标识抗体与抗原之间均有乳白色沉积线，且沉积物含量共同，荧光剖析仪检测标识抗体与中心孔之间有黄绿色荧光条带。 定论 选用本研讨办法制备的荧光抗体具有纯度高、荧光性好、特异性强等特色，为临床检测人体Ⅳ型胶原含量供给便当。

[关键词] Ⅳ型胶原；荧光抗体；荧光素；FITC

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）01-37-03

[Abstract] Objective To lay the foundation of detecting the content of Ⅳ type collagen in human liver or blood through direct or indirect fluorescent method， Identifying monoclonal antibody of collagen typeⅣ by using the fluorescein isothiocyanate. Methods Using a direct dialysis method to identification of fluorescein. The purity of the identifying fluorescent antibody were obtained by Sephadex G-25 gel filtration column， which remove excess fluorescein and other impurities. The purity， fluorescence characteristic and specificity of antibody were measured with SDS-PAGE and double immune diffusion gel electrophoresis. Results The results of SDS-PAGE electrophoresis were measured by fully automatic chemiluminescence fluorescence image analyzer. Eexcitation wave 490nm and emission wave 510nm. The purified of antibody were shown only one strap of yellow with green fluorescence and the molecular weight （MW） of them were estimated to be approximately 150kD， its purity was 96%， there were not any other strap. The result of double agar gel immune-diffusion test showed that both identify antibodies and not identify antibody were combination with antigen， all of product were formed milky white precipitation lines of antigen-antibody complexes with antigen. And the sediment content was consistent. There was a strap of yellow with green fluorescence in the center hole by fluoroanalyzer. Conclusion In this study， the fluorescent antibody against human collagen type Ⅳ with high purity and strong specificity was produced by separation and purification methods， which provide convenience for clinical detection of the human body Ⅳ type collagen.

[Key words] Collagen type Ⅳ； Fluorescent antibody； Fluorescein isothiocyanate； FITC

免疫荧光技能是免疫检测技能中的一种。这种技能是将荧光示踪物质与抗体结合，使用抗原抗体反响的特异性，进行安排、细胞或体液内抗原物质的检测[1]。免疫荧光技能现已广泛使用于生物医学的检测中[2]。Ⅳ型胶原（ColⅣ）首要存在于各器官的基底膜中，是基底膜的微量成分，许多具有增生性质的疾病，ColⅣ含量与病变程度呈正相关；特

别是在肝纤维化的确诊和分型方面，ColⅣ在体内和安排中含量的检测更为重要[3-4]。本研讨选用异硫氰酸荧光素（FITC）标识Ⅳ型胶原单克隆抗体，一起对标识后抗体的荧光性及特异性进行判定剖析[5]，为树立直接荧光和直接荧光检测办法奠定根底，现报导如下。

1 资料与办法

1.1 首要仪器

X100冷冻高速离心机（HITACHI）、LP型低压层析系统（BIO-RAD）、2000C微量紫外可见光检测仪（Thermoscientific）、F-4600荧光分光光度计（Hitachi）、2500+蓝光凝胶剖析仪（上海天能）、5500multi+RGB全自动化学发光荧光图画剖析仪（上海天能公司）。

1.2 首要试剂

Ⅳ型胶原抗体（本试验室制备）、Sephadex G25凝胶填料（GE）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）（Sigma公司）、其他试剂均为国产试剂。

1.3 FITC符号Ⅳ型胶原抗体的制备和纯化

选用透析法符号、凝胶过滤法纯化[6-7]。取抗体溶液10mL，抗体含量为9mg，充沛溶解。15000g/min，4℃，离心20min。弃上清，沉积溶解于4mL pH9.8 NaHCO3缓冲液中，吹打混匀，溶液置透析袋中对上述缓冲液，4℃，透析6h，期间3次替换透析外液，透析进程在轻柔拌和中进行。透析完毕，透析内液5000g/min，4℃离心20min。取上清，微量紫外分光光度计检测抗体含量为1.62mg/mL。上清装入透析袋，置荧光标识液（200mL pH 9.8NaHCO3缓冲液+FITC 20mg至终浓度为0.1mg/L），避光4℃透析过夜。置透析袋于PBS中，停止反响透析10h，期间数次替换PBS至检测480nm吸光值为零。取葡聚糖凝胶（SephadexG-25）10g，溶于去离子水中12h后装柱。柱长1.5×30cm，200mL PBS平衡柱，将标识抗体溶液使用于SephadexG-25层析柱，流速0.2mL/min，馏分体积5mL/tube，紫外280nm监测，搜集榜首峰，体积为15mL；抗体浓度为0.51mg/mL。分装后-80℃保存备用。

1.4 荧光抗体的判定

1.4.1 标识抗体的荧光特性及纯度测定 选用SDS-PAGE电泳及凝胶剖析仪、凝胶荧光剖析仪判定标识抗体的荧光特性[8]。SDS-PAGE非还原性凝胶电泳（样品缓冲液中不增加β-巯基乙醇），别离胶10%，浓缩胶3%，恒压200V电泳2h。剥离胶板，蒸馏水浸洗2min，RGB多色荧光剖析仪检测。荧光检测完毕后，胶板用R-250考马斯亮蓝（0.25%）染色后，凝胶成像仪调查。

1.4.2 标识的荧光抗体特异性测定 选用凝胶免疫双向电泳检测法[9]。0.9%盐水琼脂糖制备琼脂板；待琼脂凝结后，打孔器打孔，孔径3mm，孔距10mm；加样，1孔加纯化后荧光抗体溶液（0.3mg/mL）、2孔参加未标识抗体溶液（0.3mg/mL）、3孔参加生理盐水对照、中心孔参加Ⅳ型胶原（0.5mg/mL）；每孔加样品20μL；琼脂板玻片置37℃温箱中12h。

2 成果

2.1 荧光抗体荧光特性和纯度

5500multi+RGB全自动化学发光荧光图画剖析仪检测电泳成果，激起波490nm，发射波510nm，标识抗体在150KD有一条黄绿色荧光带，其他的方位未见条带呈现；凝胶经染色后，凝胶成像仪检测可见标识、未标识抗体在150KD处均有一条带，其他处有染色较浅的散在条带（图1）。凝胶剖析仪剖析标识抗体纯度为96%。

3 评论

免疫荧光技能是使用荧光素对抗体（抗原）进行符号，之后用于免疫检测。近年来，免疫荧光技能迅速发展，以其灵敏度高，准确性强等特色，广泛使用于生物医学和临床确诊[10]。抗体的荧光标识作用决议了荧光检测成果的准确性，决议标识作用的要素除了荧光素偶联的程度，更重要的是标识抗体的纯度[11]。本研讨选用透析标识法衔接荧光素和抗体。选用Sephadex G25柱层析去除未符号的荧光素和杂质，经重复试验断定其层析流速为0.2mL/min。SDS-PAGE电泳成果显现符号抗体纯度到达96%。经RGB多色荧光剖析仪剖析成果，标识后的抗体，在激起荧光490nm，发射波510nm处可见黄绿色荧光，契合FITC荧光素的荧光特性[12]。选用免疫双向凝胶电泳办法检测标识荧光抗体的特异性，成果显现1孔和2孔与中心孔之间均有沉积线构成，且线的粗细程度根本相同。经荧光剖析仪检测，可见1孔与中心孔之间有黄绿色线状荧光。

综上所述，本办法在惯例透析标识后经Sephadex G25凝胶过滤层析后，可有用去除未衔接的荧光素和其他杂质，进而确保了标识后抗体的纯度。标识后抗体的特异性从双向分散免疫电泳成果剖析，根本没有丢失。试验成果证明经本办法可取得纯度高，特异性强的Ⅳ型胶原荧光抗体。为临床选用直接和直接荧光法检测人体Ⅳ型胶原，供给了便利条件，为临床前期确诊肝纤维化奠定了根底。

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（收稿日期：2014-10-21）