火把花根片和雷公藤：

郭菊玲++杨勇帮++蒋春艳

摘要：意图树立体系、科学的火把花根中雷公藤甲素的提取和含量测定的办法，为科学点评和有用操控火把花根的质量供给了牢靠的办法。 办法选用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；活动相为水-甲醇；流速为1.0 mL/min；检测波长为217 nm；柱温为35℃。 成果火把花根中雷公藤甲素的峰得到有用的别离，HPLC检测条件、办法的专特色、线性、重复性、精细度、稳定性、回收率杰出，该办法能够用于雷公藤甲素的含量测定。 定论该办法对往后的火把花根的质量操控和科学点评供给了参阅根据。

关键词：火把花根；雷公藤甲素；HPLC；含量测定

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）11-0071-04

火把花根又叫昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.]是卫矛科（Celastraceae）雷公藤属[Tripterygium Wilfodii（Hook.）f.]落叶披散或蔓状灌木植物，又叫雷公藤、断肠草、紫金皮、掉毛草、六方藤等。生善于向阳山坡、路旁边或灌木丛中，一般作为药用的部位为根和皮，昆明山海棠为我国特有的植物，民间药用中草药。首要散布于我国的西南地区，云南省境内尤为多见，首要会集散布于昆明、楚雄、红河、玉溪等地。火把花根彝语为“一姑妹班”、“多争唯”意译为“开花像火把样通红的植物。在西南地区彝族药用历史悠久。首要用于医治慢性肾炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮等。火把花一名始载于《本草纲目》，李时珍集解曰：“生滇南者花红，呼为火把花。[1]昆明山海棠有用成分研讨多有报导，可是其含量测定研讨罕见。火把花根药材收载于《云南省药品规范》（1974年）、《云南省中药材规范》第二册·彝族药（2005年）。现行《我国药典》收载的昆明山海棠片以分量法进行含量测定，且测定办法相对简略，查验灵敏度、重现性还有待进步[2]。上述规范中均无火把花根药材的含量测定项目，有必要对此项目进行研讨。

火把花的化学成分较为杂乱，长时刻研讨发现火把花中含有生物碱类雷公藤碱（wilfordie）、雷公藤次碱（wilfori）、雷公藤甲素（Triphonide）等，其间最首要的活性成分为雷公藤甲素。[3]雷公藤甲素为环氧二萜类内脂化合物，其药理效果为：抗排挤效果、抗肿瘤效果、抗生育效果等。[4]雷公藤甲素有较强的抗肿瘤活性，并具有广谱、高效等特色，能够用于类风湿性关节炎、强直性关节炎等多种自身免疫疾病和炎性疾病的医治。[5]现在，关于火把花根中的雷公藤甲素的含量测定办法已经有文献报导，可是由于研讨的办法不行完善和共同，得出的成果差异性较大。因而，本次研讨在现有的火把花根中雷公藤甲素的含量测定的根底上，运用HPLC色谱法，对火把花根药材进行了一系列的实验，树立了一个对火把花根中雷公藤甲素进行含量测定的办法，为往后科学点评和有用操控雷公藤药材的质量供给了牢靠的科学根据。

1仪器与试药

1.1仪器安捷伦1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司真空在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器），赛多利斯BSA224S-CW电子天平，赛多利斯BP211D电子天平，DHG-9104型鼓风干燥箱，KQ-500E型超声波清洗器，YS-04A小型高效粉碎机，Agilent Cary 60 UV-Vis紫外分光光度仪。

1.2试药雷公藤甲素对照品（我国食品药品检定研讨院）批号为：111567-201404，标明量为：99.8%；剖析纯：甲醇（四川西陇化工有限公司）、三氯甲烷（四川西陇化工有限公司）、乙醚（四川西陇化工有限公司）、乙酸乙酯（四川西陇化工有限公司）、中性氧化铝（国药集团化学试剂有限公司，200-300目），批号为：20130328色谱纯为甲醇（德国默克试剂公司）；水为超纯水。

2办法与成果

2.1薄层色谱辨别取本品粉末约5 g，加80%甲醇30 mL，超声30 min，放冷至室温，滤过，取滤液。滤液加三氯甲烷振摇提取3次，每次15 mL，兼并三氯甲烷液，并将滤液低温蒸干。残渣加5ml甲醇彻底溶解后用含5 g中性氧化铝的洗脱柱（内径为1.2 cm，200目），洗脱液为甲醇：乙酸乙酯：乙醚=1：2；1 60 mL进行洗脱至无色，蒸干洗脱液，残渣加1 mL甲醇溶解作为供试品溶液。另取雷公藤甲素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《我国药典》2015年版四部公例0502）实验，汲取上述两种溶液各10 uL，别离点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷—乙醚（2：1）为打开剂，打开，取出，晒干，喷以2%3，5—二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/l氢氧化钠乙醇液的混合液（临用前按1：3混合）作为显色剂，喷雾显色，天然光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的方位上，显相同色彩的斑驳。

2.2检测波长的断定取雷公藤甲素对照品适量，精细称定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为雷公藤甲素对照品溶液。取雷公藤甲素对照品溶液经紫外分光光度仪进行波长扫描，最大吸收波长为217 nm。成果如图1，由图1可知，雷公藤甲素的检测波长为217 nm。图1雷公藤的全波长扫描图谱

2.3色谱条件与体系适应性色谱柱：Agilent Venusil PLOW-C18柱（4.6×150 mm，5 um）；活动相：甲醇-水（40：60）检测波长：217 nm柱温：35℃；流速：1 mL/min；进样：10 uL；剖析时刻：40 min。

2.4溶液的制备

2.4.1对照品溶液的制备对照品溶液制备：取雷公藤甲素对照品适量，精细称定，加甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.4.2供试品溶液的制备供试品溶液的制备：取本品粉末（过三号筛）约5 g，精细称定，置具塞锥形瓶中，精细参加甲醇30 mL，称定分量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30 min，放冷，再称定分量，用甲醇补足减失的分量，摇匀，滤过，滤液移置分液漏斗中，加水7 mL，用氯仿振摇提取3次，每次15 mL，兼并氯仿液，蒸干，残渣搬运至中性氧化铝柱用60 mL洗脱液进行洗脱（中性氧化铝：5 g；洗脱柱内径：1.2 cm；洗脱液体积：60 mL；洗脱液：甲醇-乙酸乙酯-乙醚=1∶2∶1），搜集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，搬运至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5办法学调查

2.5.1专特色调查在检测波长：217 nm；柱温：35℃；进样量：10 uL；活动相：甲醇-水（40：60）；的HPLC色谱条件下，将雷公藤甲素对照品溶液、样品溶液进行HPLC剖析，得到相应的色谱图。成果如图2所示，对照品的保存时刻与样品的保存时刻共同，阐明该检测条件、办法专特色杰出。图2雷公藤样品图谱

2.5.2线性关系调查取雷公藤甲素对照品，别离制造成浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的对照品溶液，进行高效液相色谱剖析，以进样浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积（mAU*s）为纵坐标，制作规范曲线，得回归方程：Y=20507X-6.3579，R2=0.9999，成果见表1。实验成果标明在进样浓度为0.01mg/ml～0.06mg/ml的范围内，线性关系杰出。

2.5.3重复性调查依照供试品溶液的制备办法重复处理六份供试品溶液，进样10 uL，进行高效液相色谱法检测，并记载雷公藤甲素的峰面积，成果见表2，由检测成果可知RSD%<3%，标明高效液相色谱法检测条件、办法的精细度杰出，可用于雷公藤甲素的含量测定。

2.5.4精细度调查精细汲取同一对照品溶液，进样10 uL，平跋涉样5次，记载雷公藤甲素色谱峰的峰面积，核算RSD%值。成果见表3，可知RSD%<3%，标明HPLC检测条件、办法的精细度杰出，可用于雷公藤甲素的含量测定。

2.5.5稳定性调查取同一供试品溶液，别离在0、2、4、6、8、10、12、18、20、24 h进样10 uL，并记载雷公藤甲素的峰面积，带入Y=20507X-6.3579，R2=0.9999核算含量，核算RSD%值为1.74%，成果显现此办法样品24 h内稳定性杰出。

2.5.6回收率实验别离精细称取已知含量（0.0186 mg/g）的供试品3个分量梯度共6份，分为3组，每组两份，制造一个浓度（0.02 mg/mL）的雷公藤甲素对照品溶液，别离向样品溶液中参加3.4 mL、4.65 mL、5.6 mL的规范品溶液。将上述6份样品别离样品别离进样10 μL进行HPLC剖析，测定雷公藤甲素的峰面积，核算相应回收率及RSD%值。成果为：均匀回收率为98.9%，RSD%为1.80%，标明该HPLC检测条件、办法的牢靠性强。成果见表5。

3评论

（1）火把花根的化学成分杂乱，并且雷公藤甲素的自身含量极低，用一般的提取办法很难将雷公藤甲素从火把花根中提取出来，很多文献报导的测定办法很少有给出色谱图，有色谱图的雷公藤甲素的峰面积较小且别离度不行，本次研讨经过很多的实验，发现用氯仿萃取后经过中性氧化铝柱层析，加洗脱液进行洗脱后，雷公藤中雷公藤甲素的得到了很好的别离。调整洗脱液的用量，雷公藤甲素洗脱彻底，雷公藤甲素的含量也明显增加。此次研讨重复屡次对样品前处理办法进行来探究，为运用HPLC法测定火把花根中雷公藤甲素的含量打下了坚实的根底。该含量测定办法对往后的火把花根的质量操控和科学点评供给了参阅根据。

（2）含量测定办法建立的进程中，样品前处理至关重要。前期薄层色谱筛查的时分，由于样品中雷公藤甲素含量很低，但其又是药理活性成分。所以选其为质控方针物。纵观整个样品处理进程对药品企业药品生产工艺有实践指导意义。民族民间运用火把花根大多以酊剂，以用乙醇溶液浸泡的方式呈现，药效明显；运用汤剂的很少。本次研讨中，也用过水以及不同的甲醇溶液进行提取。终究发现用甲醇提取时，雷公藤甲素的提取功率最大。这就提示咱们从事传统民族民间药物的现代工艺开发研讨一定要尊重传统民间医药的用药习气，才干有的放矢。才干真实推进民族药的开展。

参阅文献：

[1]张飞行，耿会玲，杨维霞.昆明山海棠的化学成分及药理活性研讨进展[J].中草药，2012，23（6）：42-44.

[2]卫生部.我国药典[S].北京，化工出版社，2015.1056.

[3]王贤英、谢香菊、李胜容.中药材火把花中雷公藤甲素及表儿茶素的含量测定[J].重庆中草药研讨，2012，1（65）：17-21.

[4]刘劝，王友群.雷公藤甲素的药理效果研讨[J].我国药科大学药理研讨室，2005，29（4）：156-161.

[5]陈江飞，胡毅坚，苗彩云.雷公藤甲素药理效果研讨进展[J].我国医药工业杂志，2007，38（8）：604-606.