铜绿微囊藻迸发机理研讨中科学发现 马钱子碱微囊制备工艺的研讨
张少孩 王鸿 尚小广
[摘要] 意图 制备马钱子碱微囊，调查其影响要素，找出最优计划。 办法 以壳聚糖和明胶为囊材，马钱子碱为囊心物，选用复凝集法制备载药微囊。经过正交规划试验，以包封率、粒径为目标，断定最佳囊材比、囊心与囊材等到CaCl2的浓度，断定最优配方。调查其形状，测定其包封率、粒径、载药量、Zeta电位等。 成果 经过正交试验，制备马钱子碱微囊的最优配方：壳聚糖浓度为5 mg/mL，明胶浓度为4 mg/mL，CaCl2浓度为2%，囊心与囊材比为1∶3。3次平行制备所得的载药微囊的各参数的均匀值：包封率为28.73%，粒径为2.15 μm，载药量为10.6%，Zeta电位为12.61 mV。微囊涣散性好，外表滑润完好，囊壁明晰，无粘连。 定论 以壳聚糖和明胶为质料的复凝集法制备马钱子碱微囊具有较高的包封率，且安稳性好，制备工艺简略。
[关键词] 马钱子碱；微囊；壳聚糖；明胶
[中图分类号] R917.4 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）27-0042-04
Study on the preparation technology of brucine microcapsules
ZHANG Shaohai1 WANG Hong2 SHANG Xiaoguang2
1.Department of Pharmacology， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Hangzhou Medical College， Hangzhou 310053， China
[Abstract] Objective To prepare brucine microcapsules， investigate the influencing factors and find out the optimal scheme. Methods Chitosan and gelatin were used as the capsule materials，and brucine was taken as the core materials.Drug-loaded microcapsules were prepared by complex coagulation method. Through orthogonal design test， with the encapsulation efficiency and particle size as an indicator， the best ratio of capsule materials， ratio of core to materials and the concentration of CaCl2 were determined， and the optimal formula was determined. Its shape was observed， and the encapsulation efficiency， particle size， drug loading capacity and zeta potential were measured. Results Through orthogonal design test，the optimum formula for preparing brucine microcapsules was as follows： The concentration of chitosan was 5 mg/mL， gelatin concentration 4 mg/mL， CaCl2 concentration 2%， and the ratio of capsule core to capsule materials was 1∶3. The average values of the parameters of the drug-loaded microcapsules prepared in three parallel preparations： The encapsulation efficiency was 28.73%， particle size 2.15 μm， the drug loading capacity 10.6% and Zeta potential 12.61 mV. Microcapsules were with good dispersion， smooth and complete surface， clear wall， and no adhesion. Conclusion The preparation of brucine microcapsules with chitosan and gelatin as raw materials has a high encapsulation efficiency， and the stability is good and the preparation process is simple.
[Key words] Brucine； Microcapsules； Chitosan； Gelatin
馬钱子碱（brucine，C23H26N2O4·4H2O）为白色结晶性粉末，在水中微溶，味极苦，属剧毒品，是马钱科植物马钱子（Strychnosnuxvomical L1或云南马钱StrychnosPierriannas A.W.Hi11）种子的首要生物碱之一[1]。2010 版《我国药典》载其味苦，微温，有剧毒，归肝、脾经。有通络止痛、消肿散结之功。可用于跌打损伤，骨折胀痛，风湿顽痹，麻木瘫痪，痈疽疮毒，嗓子胀痛[2]。近年来马钱子用于冶疗多种疑难杂症均取得独特效果，外用冶疗癌痛效果更佳。有文献报导，不同粒度的马钱子粉末中生物碱的体外开释速度很快，10 min的累计开释率到达50%～80%，在80 min时根本开释彻底[3]。马钱子碱具有中枢毒性，因而这样的开释速度选用惯例办法如口服、打针等给药往往危险较大，简单引起中毒，且药效较短。期望经过恰当的制剂手法，推迟马钱子碱的开释速度，一起下降药物的毒性，到达安全用药的意图。endprint
微囊化是使用高分子质料将固体或液体药物包封起来而构成直径1～250 μm的微型胶囊[4]。微囊具有维护物质免受环境条件的影响、掩蔽药物的刺激性、进步药效，削减副效果、添加药物安稳性、延伸药物及靶向开释等功能[5，6]。经过微囊化后的药物又可以制备成各种剂型，如打针剂、散剂、植入剂、胶囊剂、颗粒剂等，便利临床用药[7，8]。本试验将马钱子碱包封在微囊中，使其给药部位可以安稳持续的开释所包裹的药物，保持稳定的血药浓度[9]，到达接连操控癌症痛苦的效果，以削减药物的副效果，进步效果和患者日子质量。尽管已有有关马钱子碱微囊的研讨报导[1，3，10]，可是选用复凝集法[11，12]制备的报导很少，为了进一步研讨马钱子碱制剂，本试验拟选用壳聚糖和明胶为囊材[11-15]，以马钱子碱为囊心物，复凝集法制备马钱子碱微囊，以包封率、粒径为目标，断定最优制备配方。并对制备所得的微囊进行相应的质量点评和体外开释试验，以保证其质量符合要求。
1 资料与仪器
1.1 资料
马钱子碱（南京泽郎医药科技有限公司，含量≥98%）；明胶（上海试剂总厂，批号为20031006）；壳聚糖（上海伯奥生物科技有限公司，批号为080116）。其他化学试剂悉数为剖析纯或化学纯。
1.2 仪器
AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SK8200HP超声波洗濯器（上海科导超声仪器有限公司）；IKARC-MAG HS4磁力拌和器；FA25高速乳匀机（上海弗鲁克液体机器有限公司）；E200MV生物显微镜（南京尼康江南光学仪器有限公司）；TDL-40C低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；DKB-501A超级恒温水槽（上海森信试验仪器有限公司）；ZEN3690激光微粒测定仪（马尔文仪器）；激光粒度剖析仪（上海精细科学仪器有限公司）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。
2 办法和成果
2.1 马钱子碱的规范曲线的测定
2.1.1 马钱子碱测定波长的挑选 精细称取27.5 mg马钱子碱，置于50 mL容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度，再精细移取2 mL稀释25倍成0.022 mg/mL的溶液；以蒸馏水为空白，在190～400 nm波长范畴内进行光谱扫描，曲线见图1，从图中可看出，马钱子碱在270 nm有吸收，200 nm邻近有结尾吸收，因而挑选270 nm作为马钱子碱的检测波长。并将所用的辅料进行以10倍的浓度在190～400 nm波长范畴内进行光谱扫描，成果显现辅料对药物的吸收没有影响。
2.1.2 线性规模及规范曲线的制造 精细称取12.5 mg马钱子碱质料药，置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，作为储藏液。取适量储藏液用0.45 μm的微孔滤膜进行过滤，精细移取续滤液 1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL和6 mL，置于25 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。采纳紫外分光光度计在270 nm波利益丈量吸光度，经线性拟合得规范曲线方程为A=0.0302C-0.0005（R2=0.999）。线性规模为0～30 μg/mL，成果见图2。
2.1.3 精细度测定 取上述浓度为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的规范溶液，别离参加最大处方量的辅料，1 d内接连测定5次，核算日内精细度，每日测定1次，接连测定5 d，核算日间精细度。成果显现日内精细度RSD为0.56%、0.35%、0.31%（n=5），日间精细度RSD为0.68%，0.74%，0.56%（n=5），一切的RSD均在1%以内，符合要求。
2.1.4 回收率试验 测定2.1.3项下的三个浓度溶液的吸光度值，并进行回收率和RSD值的核算，成果显现均匀回收率别离为（99.75±0.52）%，（98.97±0.78）%，（99.56±0.45）%，RSD均小于1%（n=3），符合要求。
2.1.5 安稳性试验 取上述浓度为10 μg/mL的规范溶液，参加最大处方量的辅料，别离于1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h在270 nm测定吸光度，成果显现溶液在12 h内安稳性杰出。
2.2 微囊的制备及其优化[16-17]
2.2.1 微囊制备条件的挑选及优化 称取适量明胶，用蒸馏水浸泡适合时刻，拌和溶解彻底后，加适量液体白腊及司盘80，用高速乳匀机制成W/O型乳液；另称取对应份额的壳聚糖浸泡超声溶于2%醋酸溶液，加CaCl2及药物，制得含药壳聚糖溶液，调理磁力拌和器温度为30℃，拌和下将其滴加到W/O型乳液中，用NaOH调理pH 4.5，持续拌和90 min，冰浴冷却至10℃，加适量戊二醛，拌和120 min。加正丁醇适量，摇匀后静置30 min，溶液离心5000 rpm 15 min，沉积用蒸馏水洗刷至无醛味，枯燥，即得微囊。
经过查阅相关文献和预试验，选取对微囊构成及包封率影响较为显着的3个要素：壳聚糖与明胶的质量比（A）、CaCl2的浓度（B）以及囊心与囊材的质量比（C），每个要素有3个水平进行试验（表1），以包封率为首要点评目标，一起以微囊粒径为参阅目标，选用L9（34）正交表进行试验，挑选出最优制备处方。正交试验成果见表2。
2.2.2 微囊包封率的测定[18] 將各处方制备的微囊混悬液5000 rpm离心15 min后的上清液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液1～3 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，于270 nm波利益丈量其吸光度值，以蒸馏水为空白。将测定的数值代入规范曲线，取得上清液的浓度，并依据下面公式核算包封率，成果见表3。
2.2.3 微囊载药量的测定[19] 精细称取25 mg枯燥微囊，研钵中研磨破坏，参加蒸馏水约15 mL，超声使微囊中的药物溶解彻底后，转移至25 mL容量瓶中，定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液于270 nm测吸光度，用规范曲线核算浓度，依照下式核算载药量。见表2。endprint
载药量（%）=微囊中的药物分量/微囊分量×100%
2.2.4 微囊粒径的测定 将制备所得到的微囊稀释到必定浓度后，用激光粒度剖析仪和ZEN3690激光微粒测定仪（马尔文仪器）别离测定粒径与Zeta电位。处方挑选的微囊的粒径和Zeta电位成果见表2。
2.2.5 处方挑选及制备工艺优化成果[5-6，16-17，20-21] 正交试验成果级极差剖析见表3，其间归纳评分=包封率×0.6+D50×0.4。微囊實验的方差剖析见表4。
从以上成果可以看出，3个要素的影响程度为B>A>C，即氯化钙的浓度>壳聚糖与明胶的质量比>囊心与囊材的质量比。最佳水平组合为A1B2C2，即制备马钱子碱微囊的最优配方：壳聚糖浓度为5 mg/mL，明胶浓度为4 mg/mL，CaCl2浓度为2%，囊心与囊材比为1∶3。
2.3 验证试验
依照所取得的最佳处方进行A1B2C2重复性试验，制得3个批次的马钱子碱微囊，测得其包封率别离为28.63%，28.74%，28.82%，均值为28.73%；载药量为10.35%，10.15%，11.31%，均值为10.6%；SMD为2.46 μm，2.75 μm，2.36 μm，均匀SMD为2.52 μm；Zeta电位为12.37 mV，13.41 mV，12.04 mV，均匀值为12.61 mV。
将所制得的马钱子碱微囊在10×10倍的生物显微镜下调查其形状，并拍下图画。再在40×10倍状态下调查并拍下图画，见封三图5和封三图6，微囊涣散性好，外表滑润完好，囊壁明晰，无粘连。
3 评论
马钱子碱作为马钱子生物碱中的首要成分之一，具有镇痛、抗炎效果，对整个中枢神经系统有挑选性兴奋效果。马钱子碱占马钱子总生物碱质量的30%～40%，归于有毒成分，使用不当简单发作中毒乃至危及生命。如要使其发挥效果，需求经过必定的制剂手法，操控体内药物量及开释速度，到达安全用药的意图。微囊作为一种制剂手法，选用适宜的高分子资料和制备办法将药物包裹，经过挑选的囊材的缓释效果，使药物在体内开释减慢，延伸药效，避免了毒性反响的发作。
复凝集法是常见的微囊制备办法，使用两种相反电荷的高分子质料作为复合囊材，在必定前提下交联，使囊材的溶解度下降而自溶液中分出，包裹囊心物成囊。本试验中选用的壳聚糖[12-13]和明胶两种囊材均为是天然化合物，无毒，有杰出的生物相容性和可生物降解性，是比较常用的药用高分子资料，易得价廉。壳聚糖为聚阳离子型多糖，明胶为两性化合物，溶液中的pH大于等电点时使其带负电荷，因而试验中要注意调理pH，使明胶一直带负电荷。本试验经过正交试验法断定了微囊制备的最佳工艺并进行了验证。经过验证，选用最佳工艺制备的微囊粒径较小，流动性好，包封率和载药量较好，重复性好。
经过试验发现除了试验所调查的三个首要要素外，其他要素也会对微囊的制备发作必定的影响，如戊二醛、正丁醇、明胶的乳化程度等。试验过程中，戊二醛起到交联固化的效果，可是要严格操控参加的量，过多会使微囊粘连严密，难以别离；参加量过少，固化不彻底，不易构成微囊。有必要要依据药物、囊材以及试验条件进行挑选，以获取最适宜的固化剂的用量，以保证取得流动性好的微囊。经过探索，在本试验条件下戊二醛最适合的量为1 mL左右。
一起在试验中发现，在固化彻底后，不参加正丁醇，微囊不能构成沉积物，难以离心别离；参加正丁醇混匀后，可见底部有沉积，由此可见正丁醇可以使微囊别离，起到促进固化的效果，进一步削减微囊间的彼此粘连。
在明胶制备W/O型乳液时，应充沛乳化，使明胶在液体白腊中充沛涣散构成液滴，以便于在后面的成囊过程中可以充沛与壳聚糖结合构成微囊，不然难以构成微囊，仅仅液滴。为了保证乳化彻底，明胶有必要充沛溶解，液体白腊时分数次参加，保证乳化彻底。
本试验选用了药剂学中常常选用的正交试验法对处方挑选和制备办法的断定进行了优选，具有必定的精细度，可是对各要素之间的交互效果不能较好的调查，这需求进一步改善。试验制备得到的马钱子碱微囊的体外开释度及体内的溶出特性是否能到达预期的要求，还有待于进一步的研讨。
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（收稿日期：2017-07-31）endprint