p38mapk信号通路 p38MAPK信号通路调控IL—6、HIF—1α及VEGF对缓慢鼻—鼻窦炎发病机制的影响
范隽++++++赵昌敏++++++刘兆芳++++++胡文婷++++++逄明杰
[摘要]意图 调查p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）在缓慢鼻-鼻窦炎（CRS）不伴鼻息肉（CRSsNP）、CRS伴鼻息肉（CRSwNP）以及正常钩突黏膜安排中表达程度的差异以及不同类型的CRS中细胞因子白介素6（IL-6）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管內皮成长因子（VEGF）的表达，评论并剖析p38MAPK信号通路在CRS中或许的效果机制。办法 选取2015年7 月～2016年7月青岛市市立医院耳鼻喉科行鼻内镜手术患者，32例CRSsNP患者窦口安排、30例CRSwNP患者鼻息肉安排和24例正常钩突黏膜安排，别离选用蛋白质印迹法（Western Blot）检测p38MAPK在三组中的蛋白表达量、用逆转录聚合酶链式反响法（RT-PCR）检测IL-6、HIF-1α 和VEGF在三组中的信使核糖核酸（mRNA）的表达水平。成果 p38MAPK在CRSsNP、CRSwNP中的表达均高于正常黏膜安排，而两组试验组间的表达差异无统计学含义（P=0.143）；IL-6在CRSsNP、CRSwNP中的表达均高于正常黏膜安排，而两组试验组间的表达差异无统计学含义（P=0.082）；HIF-1α 和VEGF在CRSwNP中表达均显着高于正常安排（P<0.05），而VEGF在CRSsNP安排和正常安排中的表达差异无统计学含义（P=0.075）。定论 p38MAPK在CRSsNP和CRSwNP中呈现出与炎性因子IL-6不同的相关性；IL-6在CRSsNP和CRSwNP中表达优势不同，在CRSsNP安排中表达量更显着，与其联系更亲近；HIF-1a及VEGF在CRSwNP安排中一起呈高表达，或许与息肉的发作相关。
[关键词]p38丝裂原激活的蛋白激酶；白细胞介素-6；缺氧诱导因子1α；血管内皮成长因子；缓慢鼻-鼻窦炎
[中图分类号] R765.21 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）03（c）-0008-05
[Abstract]Objective To observe the difference of the degree of expression of p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK） in chronic rhinosinusitis （CRS） without nasal polyps （CRSsNP），CRS with nasal polyps （CRSwNP） and normal uncinate process，and the expression of interleukin-6 （IL-6），hypoxia-inducible factor 1 alpha （HIF-1α ） and vascular endothelial growth factors （VEGF） in different types of CRS.And explore the possible mechanism of p38MAPK signaling pathway in CRS.Methods Patients with nasal endoscopic surgery in department of otolaryngology of Qingdao Municipal Hospital were selected from July 2015 to July 2016 in Qingdao municipal hospital otolaryngology.32 cases of patients with CRSsNP sinus tissue，30 cases of CRSwNP patients with nasal polyps and 24 cases of with normal uncinate mucosa were selected for the study.The protein expression of p38 MAPK in three groups was detected by Western blotting.And the mRNA expression levels of IL-6， HIF-1α and VEGF in three groups were detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR）.Results The expression of p38MAPK in CRSsNP and CRSwNP was higher than that in normal mucosa， but there was no significant difference between the two groups （P=0.143）.The expression of IL-6 in CRSsNP and CRSwNP was higher than that in normal mucosa，but there was no significant difference between two groups （P=0.082）.The expression of HIF-1α and VEGF in CRSwNP was significantly higher than that in normal tissues （P<0.05）.While there was no significant difference in the expression of VEGF in CRSsNP and normal tissues （P=0.075）.Conclusion p38 MAPK in CRSsNP and CRSwNP shows a different correlation with inflammatory factor IL-6，and the advantage of the expression of IL-6 in CRSsNP and CRSwNP is different，and the expression of IL-6 in CRSsNP is more significant and more closely related.HIF-1a and VEGF are also highly expressed in CRSwNP tissues，which may be related to the production of polyps.
[Key words]p38 mitogen-activated protein kinase；Interleukin-6；Hypoxia-inducible factor 1 alpha；Vascular endothelial growth factor；Chronic rhinosinusitis
缓慢鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是鼻窦及鼻腔的缓慢炎性疾病。其特点是病程较长，重复发作，经久难愈。常见临床症状有流脓涕、鼻塞、嗅觉妨碍，乃至头痛等[1-2]。据2012年昆明规范[3]，CRS分为两种类型：①CRS不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）；②CRS伴有鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）。炎症发作离不开炎性因子的激活、诱导。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）经过三级激酶形式顺次激活后，一起调理细胞的成长、分解、炎症反响等，在信号转导过程中发挥重要效果。p38MAPK是第1个被证明的作为抗炎药物的靶向方针，对前炎症细胞因子，如白介素6（interleukin-6，IL-6）起重要调理效果。而血管内皮成长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是因为缺氧诱导因子-1α （hypoxia inducible factor-1-alpha，HIF-1α）的高表达诱导发作的[4]，一起又加剧炎症及息肉的构成[5-6]。本课题组前期研讨标明[7]，p38MAPK信号通路能够对变应性超敏反响及炎性反响进行调理，但在CRSsNP及CRSwNP的不同炎性反响中，p38MAPK是否对IL- 6、HIF-1α和VEGF具有调理效果以及调理表达的差异性尚不清楚。本研讨拟评论在不同类型CRS患者炎性安排中，P38MAPK是否对上述细胞因子起调控效果，经过各自表达的差异性，进一步说明CRS的发病机制。
1材料与办法
1.1一般材料
本研讨经过我院医学道德委员会赞同，受试者在术前赞同参加本次研讨并签署知情赞同书，一切受试目标均来源于2015年7 月～2016年7月青岛市市立医院耳鼻喉科行鼻内镜手术患者，依照缓慢鼻窦炎医治鉴定规范（昆明规范）[2]，受试者均无变应性鼻炎、支气管哮喘、阿司匹林耐受不良和其他系统严峻疾患。典型鼻窦炎症状继续≥12周，术前1个月内未行激素和抗组胺药物医治。试验共分为3组，CRSsNP组32例，其间男15例，女17例；平均年龄（41.00±17.39）岁；鼻内镜查看无息肉构成，副鼻窦CT示窦腔有软安排密度影，取窦口黏膜安排。CRSwNP组30例，男17例，女13例；平均年龄（39.00±19.45）岁；鼻内镜查看有息肉构成，术后经病理证明为黏膜息肉，取息肉安排；对照组24例，男14例，女10例；平均年龄（33.00±13.09）岁；鼻窦CT示窦腔无软安排影，中鼻道无赘生物，取单纯鼻中隔偏曲矫正术中的正常钩突黏膜安排。一切安排标本取出后经PBS液（上海碧云天生物技术公司）清洗后一部分置于RNA保存液（北京天根生化科技有限公司）用于mRNA的提取及RT-PCR的剖析，一部分置于-80℃超低温冰箱（青岛海尔集团）中保存用于Western blot检测蛋白含量。
1.2研讨办法
1.2.1 RT-PCR检测细胞内IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA表达量 依据动物安排总RNA提取试剂盒说明书（北京天根生化科技公司）提取细胞总RNA，从总RNA提取出2 μg，依照cDNA榜首链组成试剂盒说明书（北京天根生化科技有限公司）组成cDNA榜首链，进行gDNA去除反响，逆反响系统1为：5×g DNA Buffer 2 μl，Total RNA 500 ng，RNase-Free ddH2O 补足至10 μl；反响完毕后于42℃水浴孵育3 min。在冰上进行逆转录反响2，反响系统为：10×Fast RT Buffer 2 μl，RT Enzyme Mix 1 μl，FQ-RT Primer Mix 2 μl，RNase-Free ddH2O 补足至10 μl，将系统2转移至已孵育完结的系统1中，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，冰浴5 min，得到cDNA。经PCR仪（赛默飞世尔科技）进行PCR扩增，引物及GAPDH（北京天根生化科技公司）序列如表1。制造1.5%琼脂糖（西班牙进口）凝胶电泳，凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）下调查条带照相，Image J图画剖析软件剖析电泳条带灰度值，各组与GAPDH灰度值比标明该组mRNA相对表达量。
1.2.2 Western blot检测细胞核内p-p38蛋白表达量 依据细胞核蛋白质提取试剂盒说明书（上海生工生物工程公司）提取细胞核蛋白，BCA蛋白定量办法测定细胞核浓度，制造SDS-PAGE凝胶（上海碧云天生物公司），上电泳仪（美国BIO-RAD公司）行凝胶电泳分离蛋白质，转膜，关闭1 h，参加稀释度为1∶500的p-p38兔抗人单克隆抗体及稀释度为1∶500的p38兔抗人单克隆抗体（美国Millipore公司）孵育。收回一抗后，参加HRP（美国Millipore公司）符号稀释浓度为1∶1000的二抗鼠抗兔IgG多克隆抗体（美国Millipore公司）孵育，TBST液洗刷，ELC显色。扫描仪（赛默飞世尔科技）扫描，用Image J剖析软件剖析蛋白条带灰度值，以各组与总p38的蛋白条带灰度值比值标明p-p38蛋白相对活化水平。
1.3 统计学办法
所得数据输入SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量材料用单要素方差（one-way ANOVA）剖析，差异有统计学含义，满意方差齐性，选用Tukey查验进行比较，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA的表达
CRSsNP组、CRSwNP组和对照组中的IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA表达量见表2。IL-6 mRNA在CRSsNP组、CRSwNP组中的表达量高于对照组，而两组试验组中的表达差异无统计学含义（F=64.73，P=0.082）（图1-a）；HIF-1α mRNA的表达量在CRSsNP组、CRSwNP组显着高于对照组，三组之间比较，差异均有统计学含义（F=256.39，P<0.05）（图1-b）；VEGF mRNA的表达量在CRSwNP组显着高于CRSsNP组和对照组，但CRSsNP组中的表达与对照组差异无统计学含义（F=58.95，P=0.075）（图1-c）。
2.2 p38MAPK蛋白表达水平
总p38及磷酸化p38凝胶电泳成果如图2。磷酸化p38在CRSsNP组、CRSwNP组以及对照组灰度的相对值别离为：0.6641±0.0461，0.7464±0.0914，0.2816±0.04002。三组比较，差异有统计学含义（F=76.32，P<0.05）。CRSsNP组与CRSwNP组比较，差異无统计学含义（P=0.143）；两组试验组与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05）（图2）。
3评论
炎性细胞的影响排泄是CRS的重复发作的首要原因之一，而影响炎症细胞排泄是多种要素一起效果的成果，其间一种就是p38MAPK信号通路的激活。p38MAPK信号通路在未受影响时首要散布于胞浆中，胞核区很少散布，经三级酶促级联反响后构成磷酸化p38，可进入细胞核中传递信息，进而效果于多种其他转录因子[8]，促进促炎因子的发作[9]。曾有研讨标明：p38MAPK信号通路对鼻息肉的发作开展或许有必定的耦联效果[10]，本次研讨中，p-p38MAPK在CRSwNP中的高表达也证明了此说法。但一起在本研讨中，CRSsNP与CRSwNP中p-p38MAPK的蛋白含量无显着差异，IL-6在两者中的表达也无显着差异，可推断，炎症的发作与p38MAPK及IL-6均有关。IL-6经过部分炎症微环境调控，在鼻黏膜炎性反响过程中起重要效果[11]，当鼻腔的炎症细胞受某种要素影响后，以自排泄或旁排泄构成发作，并效果于发作细胞本身，加剧机体炎性反响[12-13]。
在临床上，CRSsNP患者黏膜安排充血水肿，淋巴细胞和浆细胞充满滋润，炎性因子排泄，纤维安排增生致使血管阻塞，然后腺体萎缩，故体现为下鼻甲萎缩而中鼻甲反而显着水肿，中鼻道变狭隘，鼻腔通气较差。而鼻通气妨碍使鼻腔部分氧含量的下降，构成缺氧状况，诱导缺氧因子的排泄，尤其是转录因子HIF-1α的排泄，又促进了VEGF生成血管，为缺氧安排供给血供，水肿的黏膜安排呈息肉样变。VEGF 作为最强有力的血管通透因子，具有添加微血管通透性的功用，在体内可诱导血管的发作[14]。本研讨中，CRSwNP患者息肉安排中的HIF-1α和 VEGF mRNA均呈高表达，这是因为当鼻腔狭隘，部分氧浓度下降，鼻黏膜细胞相互连接为“拟态血管”[15]，能为息肉前期供氧及促进成长速度。国内外研讨证明，在低氧或缺血条件下，HIF-1α能添加 VEGF mRNA 的转录，缺血或缺氧安排能够经过开释旁排泄因子或调理转录后机制上调 VEGF 受体的表达，然后发动血管重生[16]。低氧能够诱导mRNA 编码 VEGF 稳定性添加[17]。缺少 HIF-1α的表达，VEGF mRNA 水平显着下降，即便在低氧条件下，VEGF mRNA 也未被诱导表达[18]。
综上所述，当鼻腔遭到外界炎性反响影响时，p38MAPK活化构成p-p38MAPK，诱导炎性因子IL-6的高表达。鼻黏膜炎症继续开展，没有得到有用操控时，促炎症细胞因子如IL-1、IL-6和TNF等在保持炎症过程中起了重要效果，又因为解剖结构的差异性以及鼻黏膜水肿继续存在，鼻腔通气引流较差，又诱导了缺氧因子HIF-1α在巨噬细胞的高表达，而VEGF对毛细血管和小静脉的特异性通透性，使血管通透性添加，使大分子物质易于穿透血管壁，导致血浆外渗，细胞外液增多，使安排发作水肿。水肿鼻黏膜安排的上皮层不断增殖增厚，逐步构成成长性安排即鼻息肉，又反过来影响VEGF的排泄来供给血管[19]。
可是，有关CRS不同类型患者安排中IL-6表达的成果并不共同，如肖志超[20]的研讨显现，IL-6在单纯CRS患者及CRSwNP患者黏膜中的表达量无显着差异性。在黄正华等[21]的研讨中HIF-1α mRNA与VEGF mRNA 的表达水平在鼻息肉组与对照组中无显着差异性。不同成果的发作或许是因为试验办法不同，也或许因为病况差异而体现不同，因而还有待进一步研讨和证明。一起，研讨p38MAPK信号通路对IL-6、HIF-1α与VEGF的影响及其相互联系，也在难治性CRS复发的操控与医治中有必定的临床含义。
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