接种麻疹疫苗后多久发生抗体 儿童麻疹疫苗接种后远期抗体水平及Th1/Th2细胞因子排泄特征
汪培勤+++汤菊妹++王健容++唐美丽++郭锦锦++孙万邦
[摘要]意图 通過检测儿童接种后远期血清抗体水平缓T细胞亚群排泄细胞因子，点评其体液免疫持久性及其对细胞免疫功用的影响。办法 2013年1月～2015年7月在深圳市龙岗区妇幼保健院儿童保健科体检的儿童，挑选麻疹疫苗接种的儿童32名，接种时刻为3～10年，取外周血2 ml别离血清，用ELISA法检测麻疹抗体；依据麻疹抗体水平检测成果将一切受试者分组，即低应对组（9.00～19.99 IU/L）、中应对组（20.00～199.99 IU/L）和高应对组（200.00～320.00 IU/L）；将麻疹疫苗接种的32例儿童血液标本别离的外周血单个核细胞（PBMC）进行培育，培育中规划不加麻疹疫苗的对照组、加疫苗影响的试验组。用细胞因子微球检测技能检测细胞培育上清液中Th1细胞因子TNF-α和Th2细胞因子IL-10。成果 抗体阳性率为81.2%，抗体水平为（115.03±95.20）IU/L；高应对组抗体水平显着高于中应对组和低应对组（P<0.05）；试验组和对照组因子水平的中位数别离2021.81 pg/ml（TNF-α）、2566.93 pg/ml（IL-10）和1481.72 pg/ml（TNF-α）、1861.89 pg/ml（IL-10），试验组的TNF-α和IL-10水平显着高于对照组（P<0.05）。定论 儿童麻疹疫苗接种后抗体阳性率较高，且接种后体内存在免疫回忆性T细胞，在触摸抗原影响后可介导细胞免疫应对。
[关键词]麻疹疫苗；抗体；细胞因子；远期免疫；免疫回忆
[中图分类号] R725.111 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（b）-0004-05
Antibody levels and the secreting characterization of Th1/Th2 cytokines in the children long term after vaccination with measles vaccine
WANG Pei-qin1 TANG Ju-mei1 WANG Jian-rong1 TANG Yan-li1 GUO Jin-jin2 SUN Wan-bang2▲
1.Department of Pediatrics，Shenzhen Longgang Maternal and Child Health Care Hospital，Guangdong Province，Shenzhen 518172，China；2.Immunology Teaching and Research Section，Zhuhai Campus of Zunyi Medical College，Guangdong Province，Zhuhai 519041，China
[Abstract]Objective To detect the serum antibody level and cytokine secretion of T cell subsets in children after vaccination，and to evaluate the effect of humoral immunity and cellular immunity.Methods A total of 32 children with measles vaccination for 3-10 years were selected in Children′s Health Care Department of Longgang District Maternal and Child Health Care Hospital of Shenzhen from January 2013 to July 2015. 2 ml blood samplewas used for measure measles antibody titers by ELISA from isolated serum，who were divided into low response group （9.00-19.99 IU/L），middle response group （20.00-199.99 IU/L） and high response group （200.00-320.00 IU/L） according to the results of measles antibody levels.The peripheral blood mononuclear cells （PBMC） were isolated from the other 3 ml blood sample.The experimental group，stimulated by measles vaccine （3.0 μg/ml） and control group were set，without stimulation.Both groups were cultured and taken to detect TNF-α and IL-10 by Cytometric Bead Array （CBA）.Results The positive rate of antibody was 81.2%，of which the level was （115.03±95.20） IU/L.The antibody level in the high response group was significantly higher than those in the medium response group and low response group （P<0.05）.The medians of factors in the experimental group and control group were respectively 2021.81 pg/ml （TNF-α），2566.93 pg/ml （IL-10） and 1481.72 pg/ml （TNF-α），1861.89 pg/ml （IL-10），and the TNF-α and IL-10 levels in the experimental group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）.Conclusion Thepositive rate of antibody is high in children after vaccination with measles vaccine，and there are immune memory T cells，which can mediate cell-mediated immune response when exposure to antigen stimulation.
[Key words]Measles vaccine；Antibody；Cytokine；Long-term effect；Immunological memory
麻疹（measles vaccine，MV）是幼儿时期常见的急性呼吸道流行症，首要由麻疹病毒感染所构成的感染性极强。肺炎、脑炎等均是麻疹麻疹患儿常见并发症，也是导致病死率居高不下的首要原因。据计算，截止19世纪90年代，全球约有4000万麻疹病例，约有100万逝世，较麻疹疫苗接种前显着下降[1]。我国于2006年参阅WHO主张，提出综合性消除麻疹战略，该战略中将儿童惯例免疫干涉作为根底，并鼓舞强化麻疹疫苗免疫處理，旨在进步幼儿集体的机体反抗才能[2]。尔后我国麻疹发病率降至2012年的最低点挨近4.5/100万，但从2013年开端又显着上升，至2015年的发病率挨近38/100万，逝世人数也从2012年的8人升至2015年的32人[3]，未能到达世界卫生大会断定的方针，即到2015麻疹发病率<5/100万[4]。近年的麻疹病例除儿童外，也有成人麻疹病例[5-6]。因而，关于麻疹疫苗接种后的远期免疫效果有必要重新认识。既往关于儿童麻疹疫苗接种的研讨中，大多着重于抗体水平检测以及近远期效果调查，关于对回忆免疫细胞功用检测点评接种效果的切入点研讨尚鲜有报道。鉴于此，本研讨特对麻疹疫苗接种的儿童进行依据回忆免疫细胞功用水平的检测研讨，从免疫回忆的视点来点评接种麻疹疫苗后的远期效果。
1材料与办法
1.1一般材料
从2013年1月～2015年7月在深圳市龙岗区妇幼保健院儿童保健科体检的儿童，挑选接种过麻疹疫苗的儿童32名作为受试方针，其间男性18名，女人14名，年纪7～10岁，均匀年纪（8.3±1.0）岁。当选规范：末次接种麻疹疫苗后时刻为3年以上，家长均知情赞同者；扫除规范：有麻疹病史，兼并有其他类型严峻体系性疾病者，存在有免疫体系缺点疾病者。本研讨契合医院医学道德条件。依据麻疹抗体水平检测成果将一切受试者分组，即低应对组（10例，9.00～19.99 IU/L）、中应对组（8例，20.00～199.99 IU/L）和高应对组（14例，200.00～320.00 IU/L）。低应对组中男性6例，女人4例；年纪7～10岁，均匀年纪（8.6±1.3）岁。中应对组中男性5例，女人3例；年纪7～10岁，均匀（8.5±1.2）岁。高应对组中男性7例，女人7例；年纪7～10岁，均匀（8.6±1.2）岁。三组间一般材料比较，差异均无计算学含义（P>0.05），具有可比性。
1.2办法
1.2.1首要试剂与仪器 麻疹病毒（MV Ab）ELISA试剂盒由深圳晶美生物科技公司供给；TNF-α CBA、IL-10 CBA试剂盒均由美国Becton Dickinson公司供给；胎牛血清、改进型RPMI-1640培育液均由宝生物（大连）公司供给；麻疹减毒活疫苗购自上海生物制品研讨所；CO2培育箱购自美国RAD公司；流式细胞仪（FACS Calibur型）置办美国贝克曼库尔特公司。
1.2.2分组办法 将麻疹疫苗接种的32例儿童血液标本别离的PBMC进行培育，培育中规划不加麻疹疫苗为对照组，加疫苗影响为试验组。
1.2.3检测办法 标本无菌采受试者静脉血5 ml，分装。其间2 ml天然凝结，并离心别离，取上清液用测麻疹抗体水平，所用办法为ELISA，别离血清后，参照阐明书过程测得规范品的OD值及样品OD值，然后计算出规范曲线回归方程，可将OD值代入上述方程中，然后得出样品浓度；另3 ml置于抗凝管中，于5 min后参加3 ml D'Hank's液。摇晃均匀后向其间参加2 ml淋巴细胞别离液，离心，并对淋巴细胞施行洗刷处理。加2 ml培育液，离心别离，取沉积细胞，调整淋巴细胞，使其浓度达细胞数1×106/ml。将上述样品参加96孔培育板中，每孔样品量为100 μl。每组设置3个复孔，其间试验组参加浓度为3.0 μg/ml的麻疹疫苗；对照组则加等量无菌生理盐水，并于每孔中参加100 μl浓度为10%的培育液，置CO2培育箱中（浓度为5%），培育条件：37℃，50 h。取上述样品离心别离，转速为800 r/min，处理时刻为5 min。用流式CBA法检测细胞因子操作过程参照阐明书制造规范品与待测样本，BD-FACS Calibur流式细胞仪检测细胞因子TNF-α、IL-10。搜集结束后，用FCAP Array v1.0软件制作规范曲线并剖析数据。
1.3调查方针
调查本组患儿血清麻疹抗体浓度、不同组间血清麻疹抗体水平凹凸检测成果、接种麻疹疫苗不一起刻抗体水平成果、接种麻疹疫苗不同次数的抗体检测成果、试验组和对照组麻疹疫苗接种儿童TNF-α和IL-10水平检测成果。
1.4计算学办法
选用SPSS 19.0计算学软件进行数据剖析，计量材料用均数±规范差（x±s）标明，两组间比较选用t查验，不服从契合正态分布数据改用中位数标明，两组间比较选用秩和查验；计数材料用率标明，组间比较选用χ2查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1血清检测成果
血清检测的麻疹抗体成果为契合正态分布的数据，成果显现：在9.00～320.00 IU/L区间内均能检测到麻疹病毒抗体，但抗体水平差异较大，抗体水平为（115.03±95.20）IU/L（图1）。
2.2不同组间抗体水平检测成果
32例受试者均检出抗体，低应对组浓度为（18.49±1.09）IU/L，中应对组浓度为（92.40±59.31）IU/L，高应对组浓度为（259.25±32.60）IU/L，分组比较成果显现，高应对组抗体水平高于低应对组及中应对组（P<0.05），其间抗体阳性率为81.2%（图2）。
与高应对组比较，▲P<0.05
图2 不同血清抗体的浓度比较
2.3接种麻疹疫苗不一起刻抗体水平成果
为了调查32例儿童接种麻疹疫苗后不一起刻抗体水平改变，依据接种时刻分组，最终1次接种后继续时刻3～6年的抗体浓度为（128.12±93.94）IU/L，继续时刻7～8年的抗体浓度为（89.29±76.47）IU/L，继续时刻9～10年的抗体浓度为（134.01±123.46）IU/L，成果显现组间差异无计算含义（P>0.05）（图3）。
2.4接种麻疹疫苗不同次数的抗体检测成果
为了调查麻疹疫苗接种次数抗体水平的状况，依据方针接种疫苗的次数不同进行分组，单次组抗体浓度为（126.82±113.71）IU/L，屡次（2～4次）组抗体浓度为（101.68±70.23）IU/L，对组间抗体水平再进行剖析，成果显现：单次接种与屡次接种麻疹疫苗的抗体水平无显着差异（P>0.05）（图4）。
2.5麻疹疫苗接种儿童TNF-α检测成果
成果为非正态分布数据，计算剖析显现在麻疹疫苗影响的试验组的TNF-α中位数为2021.81 pg/ml，对照组的中位数为1481.72 pg/ml，两组差异有计算学含义（P<0.05），提示PBMC在承受麻疹疫苗影响后发作Th1细胞因子TNF-α显着增高；与对照组比较，中应对组、高应对组均显着增高，差异有计算学含义（P<0.05）（表1）。
2.6麻疹疫苗接种儿童IL-10检测成果
成果为非正态分布数据，计算剖析显现在麻疹疫苗影响的试验组的IL-10中位数为2566.93 pg/ml，显着高于对照组的1861.89 pg/ml（P<0.05），提示麻疹疫苗接种儿童的PBMC在承受麻疹疫苗影响后发作的Th2细胞因子IL-10显着增高；与对照组比较，低应对组、中应对组、高应对组均显着增高，差异有计算学含义（P<0.05）（表2）。
表2 流式CBA法检测培育液IL-10成果（pg/ml，中位数）
与对照组比较，aP<0.05
3评论
麻疹病毒属副黏病毒科，为单股负链RNA病毒。麻疹病毒感染后，机体内细胞及体液免疫均可参加免疫应对，然后使得炎症因子水平反常升高。此外，因麻疹病毒为细胞内感染，在铲除病毒方面，细胞免疫起重要效果。人免疫体系存在免疫回忆，免疫回忆是免疫接种战略研讨的根底[7]。麻疹疫苗为减毒活疫苗，接种后适应性体液免疫应对首要由B淋巴细胞所介导，B细胞承受抗原影响后，在Th细胞的辅佐下，可在呈现活化、增殖的一起发作浆细胞排泄特异性抗体或分解成为回忆性B细胞。在抗原铲除后，因为存在免疫回忆，体内仍会继续保持麻疹保护性抗体排泄[8-9]，故经过检测抗体可评价其免疫效果。本试验抗体检测成果阳性率为81.4%，阳性率较高，这与刘东磊等[10-11]的研讨成果近似，而Knuf等[12]报道麻疹疫苗接种3年后的抗体阳性率达98.5%，乃至Davidkin等[13]随访麻疹疫苗接种20年后抗体阳性率仍达95%，提示接种麻疹疫苗后远期仍有较高的保护性抗体水平。本研讨依据研讨方针未次接种麻疹疫苗后年份的不同进行剖析，也未发现抗体水平会随接种后时刻的推移而呈现下降。一起调查到屡次接种与单次接种的儿童健康志愿者间血清抗体水平并无显着差异，阐明麻疹疫苗屡次接种或许并不能进步接种者体内麻疹抗体水平。
麻疹疫苗接种后细胞免疫首要由T淋巴细胞介导，T细胞经过细胞膜外表的T细胞受体（TCR）特异性辨认抗原，经过信号转导活化、增殖并分解成为效应性T细胞或回忆性T细胞[14]。回忆性T细胞可分为效应型回忆性T细胞（TEM）和中心型回忆T细胞（TCM）。其间前者的细胞毒潜力较高，一旦接收到抗原的影响，将会敏捷组成效应分子；而后者细胞毒潜力较低，可是增殖潜力较高，一旦触摸到同种抗原，将会在短时刻内很多增殖，而且在发作效应细胞的一起排泄具有多种生物学功用的效应因子[15]。研讨显现[16]，CD8+T细胞能铲除细胞内感染的病原，而且还可以对感染的细胞发作直接杀伤效果，也可经过开释细胞因子到达抱负的杀伤感染细胞的效果，进而阻断麻疹病毒仿制和增殖。可是该细胞的发作及其功用的保持往往需求CD8+T细胞的辅佐，而二者均受控于调理性T细胞。CD4+T细胞在细胞免疫应对中是重要的效应细胞[17-18]，CD4+T细胞中Th1和Th2细胞两个功用亚群排泄的细胞因子不同，Th1细胞可排泄多种与迟发型超敏反响T细胞及TCL细胞老练、增殖和分解相关的细胞因子，如IFN-γ和TNF-α等。由此可知，介导细胞免疫应对是此类细胞的首要生理学功用，可以发挥重要的反抗细胞內病原体感染的效果。还有研讨显现[19-20]，Th2细胞可排泄与B细胞老练、增殖和分解等密切相关的细胞因子，进而促进生成抗体，介导并进步体液免疫应对反响。本研讨检测Th1细胞因子TNF-α及Th2细胞因子IL-10时，发现试验组显着较对照组增高，标明麻疹疫苗的影响使机体敏捷发作效应因子，提示机体内存在免疫回忆。TNF-α在抗病毒方面扮演着重要的人物，经过与靶细胞TNF受体结合，搅扰病毒仿制和诱导细胞凋亡[21-22]，IL-10具有多种免疫功用，它在病毒等感染过程中首要行使免疫调理功用[23]，它可以一起按捺Th1和Th2细胞发作多种因子，对CD4+T细胞的增殖及具有多种生物学功用和效应的细胞因子的组成也有不同程度的按捺造用。此外，IL-10对淋巴细胞中增殖也有必定的按捺造用[24]。本研讨中试验组IL-10显着增高，提示Th2也显着活化、增殖并分解效应性T细胞，对Th1细胞相关的因子的排泄发作调理和按捺造用，避免机体发作过度炎症反响乃至构成组织细胞过度损害。另一方面，该物质还可对B细胞增殖转化发作促进效果，促进B细胞分解为浆细胞，然后可以确保组成和排泄更多的抗体，充分发挥其保护性效果。Th1/Th2细胞因子的高排泄从因子水平上标明麻疹疫苗接种的高效性，提示麻疹疫苗接种能促进机体发作关于麻疹病毒的免疫回忆。最终，高应对组的抗体排泄水平远远高于低应对组和中应对组，证真实麻疹疫苗接种的儿童机体中抗体水平高者再次触摸抗原后，可以更为敏捷地发作才能更强的效应因子。
综上所述，麻疹疫苗接种后的高保护性抗体阳性率以及疫苗影响后Th1/Th2细胞因子排泄标明免疫回忆状况。虽然我国麻疹疫苗接种首要实施方案免疫，可是依然存在较多没有接种麻疹疫苗的儿童。为提前完成WHO建立的方针（至2020年消除麻疹）[4]，应该强化免疫，确保全面掩盖。现在仍存在麻疹疫苗接种后再感染的状况，乃至有成人感染的现象，估测其间原因或许为接种后部分人群因免疫力比较低；也或许与有些个别的遗传易理性有关或许或许存在对当时麻疹疫苗无反响的基因，这个课题也是值得咱们深入研讨的方向。
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（收稿日期：2017-02-08 本文修改：任 念）