磷脂酰肌醇3激酶 磷脂酰肌醇3—激酶在间歇性低氧对立大鼠心肌缺血/再灌注损害中的维护机制
王媛媛++曹建++万建华
[摘要]意图 研讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在间歇性低氧（IH）对立大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）损害中的效果机制。办法 将60只大鼠随机分为四组，分别为假手术组（n=15）、I/R组（n=15）、IH+I/R组（n=15）、IH+I/R+PI3K按捺剂组（n=15）。将大鼠露出在低氧循环制造IH动物模型，经过球囊结扎冠脉办法制造心肌I/R动物模型，经过TTC染色断定梗死面积。选用Western blot法检测蛋白激酶B（AKt）表达。成果 与I/R组比较，IH+I/R组的心肌梗死面积下降（P<0.05），Akt蛋白表达升高（P<0.05）。与IH+I/R组比较，IH+I/R+PI3K按捺剂组心肌梗死面积添加（P<0.05），Akt蛋白表达下降（P<0.05）。定论 IH在大鼠心肌缺血损害中具有心脏维护效果，其维护机制与激PI3K信号通路有关。
[关键词]磷脂酰肌醇3-激酶；心肌缺血/再灌注；蛋白激酶B
[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（c）-0106-03
Protective mechanism of phosphatidylinositol 3- kinase on myocardial ischemia/reperfusion injury induced by intermittent hypoxia in rats
WANG Yuan-yuan1 CAO Jian2▲ WAN Jian-hua3
1.Department of Cardiology，the Third Hospital of Nanchang City，Nanchang 330009，China；2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；3.Department of Anesthesiology，Hospital of Traditional Chinese Medicine of Jingdezhen City in Jiangxi Province，Jingdezhen 333000，China
[Abstract]Objective To study the mechanisms of phosphatidylinositol 3-kinase PI3K on myocardial ischemia/reperfusion injury induced by intermittent hypoxia in rats.Methods 60 rats were randomly divided into 4 groups，included sham-operated group （n=15），myocardial ischemia/reperfusion group （I/R） （n=15），I/R+intermittent hypoxia （IH） group （n=15） and I/R+IH+PI3K inhibitor group（n=15）.Mice were exposed to intermittent hypoxia cycles to establish the IH model.I/R model was established by ligating the left anterior descending coronary artery，myocardial infarct areas were measured through TCC staining，the expression of phosphorylation of protein kinase B （Akt） was analyzed by Westen blot.Results Compared with the I/R group，the myocardial infarct size of IH+I/R group decreased （P<0.05），the expression of Akt protein increased （P<0.05）.Compared with the IH+I/R group，the myocardial infarction area of IH+I/R+PI3K inhibitor group increased （P<0.05），the expression of Akt protein decreased （P<0.05）.Conclusion There is protective effects of intermittent hypoxia on myocardial ischemia injury in rats，and the protective mechanism is related to the activation of inibitor group PI3K signaling pathway.
[Key words]Phosphatidylinositol 3-kinase；Myocardial ischemia/reperfusion injury；Protein kinase B間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）是机体某种生理和病理状态下的低氧方式，必定时刻内连续地露出于低氧环境，其他时刻均处于常氧环境。给机体重复连续中等程度的低氧影响，能增强机体对此种及更高程度低氧的耐受力，然后防止对机体真实的不可逆损害的发作[1]。前期的动物试验及流行病学查询发现，低氧习惯能够添加心脏对缺氧缺血损害的维护效果[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信号途径是细胞内重要的信号转导通路，是由PI3K活化，然后发作的类脂产品，并作为第二信使结合激活下流多种靶蛋白，结组成信号级联复合物，调理细胞增殖分解凋亡[3-4]。PI3K及下流靶蛋白所组成的信号途径是现在细胞内重要的信号转导通路之一。细胞凋亡的这两种通路都被认为是PI3K/Akt通路的下流通路，受PI3K-Akt通路的调控。PI3K超宗族在细胞成长、增殖、存活和凋亡进程中发挥重要效果。Akt是PI3K/Akt激活后的下流效应器。PI3K/Akt通路也可经过调控Caspase-3、Caspase-8以及Bcl-2宗族参加肌细胞凋亡的心肌维护效果。本试验拟评论PI3K在间歇性低氧对心肌缺血/再灌注（I/R）损害中的效果机制。
1材料与办法
1.1试验动物及试剂材料
取8～10周雄性SD大鼠60只，体重（200±20）g，由南昌大学动物试验中心供给。渥曼青霉素购自Alexis公司，小鼠抗Akt单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；蛋白浓度测定规范品购自普利莱公司；兔抗小鼠辣根过氧化物酶符号的二抗购自美国Sigma公司。
1.2动物模型树立
本试验研讨经南昌大学医学院动物道德委员会检查经过，许可证号为SCXK（赣）2009-0001。将试验动物随机分为4组，制造老鼠IH模型：露出在每日4次的低氧循环（每次承受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再氧和处理，5次），IH处理14 d，含氧量正常的降支老鼠作为对照组。假手术组（n=15）：丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，经过尾静脉打针生理盐水；I/R组（n=15）：参阅垫扎球囊法[5]制造大鼠I/R模型；IH+I/R组（n=15）：树立IH动物模型后，制造I/R模型；IH+I/R+PI3K按捺剂组（n=15）：树立IH模型，制造I/R模型时，在冠状动脉左前降支阻塞15 min前打针PI3K按捺剂-渥曼青霉素（24 μg/kg）。
1.3心肌梗死面积测定
制模完毕后处死存活大鼠，取新鲜大鼠心脏，用PBS冲刷，-20℃冰冻30 min切片，再用1% TTC 37℃染色25 min，切片放甲醛过夜增强色彩比照。梗死区不染色，非心肌梗死区染色为赤色。扫描仪扫描心脏切片，运用Image proplus 6.0软件丈量相关区域面积，梗死面积（%）=左心室安排切片梗死区面积/左心室安排切片总面积×100%。
1.4 Western blot法检测Akt蛋白表达
制模完毕后处死手术处理后的存活大鼠，经过安排色彩改动判别心肌正常安排和缺血安排，经过Western blot办法来测定Akt蛋白，提取各组心肌安排，按蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，监测蛋白浓度，搜集上清液，选用考马斯亮蓝法进行担保定量。SDS-PAGE别离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，常温下TBST关闭过夜，再参加anti-Akt 小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1 h，参加兔抗小鼠辣根过氧化物酶符号的二抗2 h。洗膜，显色。具体办法参照文献[9]，试验胶片扫描后用Image J软件进行图画剖析，比值成果表明蛋白的相对含量，用Gel-ProAnalyzer剖析软件剖析通道蛋白的灰度值。
1.5统计学剖析
选用SPSS 15.0统计学软件对数据进行剖析，计量材料以均数±规范差（x±s）表明，组间两两比较使用q查验，多组间比较使用单因素方差剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
与I/R组比较，IH+I/R组的心肌梗死面积下降（P<0.05），Akt蛋白表达升高（P<0.05）。与IH+I/R组比较，IH+I/R+PI3K按捺剂组心肌梗死面积添加（P<0.05），Akt蛋白表达下降（P<0.05）（表1）。
3评论
低氧是心肌缺血的主要因素，对引发缺血性心脏疾病起着重要效果。经过添加心脏对缺血、低/缺氧的耐受性来到达维护心脏的意图是临床和基础医学研讨重视的热门。IH能添加心肌对I/R损害的耐受性、削减心肌梗死面积、对立细胞凋亡、改进I/R心脏舒缩功用。有材料显现，IH习惯可减轻应激、缺血、I/R及心律失常等对心肌的损害[7-9]，不过现在关于IH的心肌维护效果机制的研讨仍是十分匮乏。
PI3K是心肌细胞内的一个重要生物分子，是细胞内信号传导有关的脂类第二信使，可参加细胞应对，在细胞存活、细胞凋亡、细胞骨架重组、囊泡运送等多种生物学事情中有重要效果[10-12]。在心肌，PI3K经过信号转导、改进心肌缩短力及直接调理钙通道钙离子内流等方面调理心肌功用[13-14]。
PI3K活化底物PI-3，4，5-P3（PIP3）与AKT结合，此刻AKT的构型发作改动，AKT被磷酸化而激活，促进细胞进入到细胞分裂周期并削减细胞凋亡[15]。Akt磷酸化后被激活，激活的Akt可磷酸化eNOS第1177位丝氨酸，使eNOS激活。eNOS是组成NO的限速酶，NO可激活蛋白激酶C和线粒体ATP敏感性钾离子通道，按捺线粒体通透性轉换孔的敞开，下降线粒体膜通透性，按捺线粒体内钙超载，改进线粒体功用，按捺线粒体开释凋亡因子而调控细胞凋亡进程[16-17].
本试验树立IH模型，发现IH预处理后能够减轻心肌I/R损害，使Akt蛋白表达添加，心肌梗死面积下降。PI3K按捺剂（渥曼青霉素）组的Akt蛋白表达下降，心肌梗死面积添加，提示心肌I/R损害在IH处理后，能够激活PI3K-Akt信号途径，使AKt磷酸化活化，削减细胞凋亡。PI3K/Akt或许经过活化内皮型一氧化氮合酶诱导抗凋亡蛋白表达添加，一起按捺促凋亡蛋白调控细胞凋亡等多种机制发挥心肌维护效果，其内涵机制值得进一步研讨讨论。
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（收稿日期：2016-12-09 本文修改：祁海文）