胰岛素反抗与多囊卵巢 电针对单纯性肥壮大鼠胰岛素反抗及下丘脑刺鼠基因相关蛋白、神经肽Y的影响

刘霞 何军锋 屈娅婷 刘志君 蒲庆阳 郭胜童 杜佳 蒋鹏飞

摘要：意图 查询电针对饮食诱导的单纯性肥壮大鼠体质量、胰岛素反抗及下丘脑刺鼠基因相关蛋白（AGRP）、神经肽Y（NPY）基因表达的影响，评论电针医治肥壮症的相关机制。办法 50只SD雄性大鼠随机分为低脂组10只和高脂组40只，高脂组大鼠造模成功后，随机分为模型组、电针组、西药组，每组10只。电针组电针“后三里”和“曲池”，每日1次，每次20 min，接连28 d；西药组予奥利司他灌胃，低脂组和模型组不做医治。每日记载大鼠体质量，检测空腹血糖和胰岛素，RT-qPCR检测下丘脑AGRP和NPY基因表达水平，HE染色查询脂肪安排和肝脏形状。成果 医治后电针组和西药组体质量、胰岛素反抗指数、AGRP、NPY、脂肪细胞直径均低于模型组（P<0.05），2组比较差异无计算学含义。电针组和西药组肝脏脂变状况均得到改进。定论 电针经过改进胰岛素反抗，按捺NPY和AGRP神经元的表达，到达操控体质量增加的意图。

关键词：电针；单纯性肥壮大鼠；体质量；胰岛素反抗；刺鼠基因相关蛋白；神经肽Y；大鼠

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0057-04

Effects of Electro-acupuncture on Insulin Resistance and Hypothalamic Agouti Gene-related Protein and Neuropeptide Y in Obesity Rats LIU Xia1， HE Jun-feng1，2，3， QU Ya-ting4， LIU Zhi-jun1， PU Qing-yang4， GUO Sheng-tong1， DU Jia1， JIANG Peng-fei1 （1. Institute of TCM Diagnostic， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Liuyang Hospital of Chinese Medicine， Liuyang City， Liuyang 410300， China； 3. Evidence Based Oriental Medicine， Sioux Falls 57106， USA； 4. Xiangxing College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To observe the effects of electro-acupuncture （EA） on body weight， insulin resistance， hypothalamic agouti gene-related protein （AGRP） and neuropeptide Y （NPY） in diet induced obesity （DIO） rats； To discuss its mechanism for DIO. Methods Fifty SD male rats were randomly divided into low fat diet groups （LFD） and high fat diet group. After the DIO models were established， the successful model rats were randomly divided into model group， EA group and Orlistat （OLST） group. EA was applied to “Zusanli” （ST36） and “Quchi” （LI11） for 20 minutes. The treatment was done once a day for 28 days. OLST was treated with orlistat by gavage. LFD and model did not receive treatment. Body weight was recorded every day. FPG and FINS were detected. The expressions of AGRP and NPY were detected by RT-QPCR. Morphological changes of adipocyte and liver were examined by HE staining. Results The body weight， HOMA-IR， AGRP， NPY and diameter of adipocyte of EA group and OLST group were significantly lower than model group （P<0.05）， difference between EA group and OLST group. The states of hepatic steatosis were improved in EA group and OLST group. Conclusion EA has the effects on weight loss by inhibiting the expressions of AGRP and NPY by improving IR.

Key words： electro-acupuncture； diet induced obesity rats； body weight； insulin resistance； agouti gene-related protein； neuropeptide Y； rats

基金项目：国家自然科学基金（81373717）；湖南省高校立异渠道敞开基金项目（12K084）；湖南中医药大学中医诊断学国家重点学科敞开基金项目（2013ZYZD13）

通讯作者：何军锋，E-mail：59421149@qq.com

肥壮症与糖尿病、高血压、高血脂等疾病亲近相关，现已成为全球医学重视的热门。电针因安全无毒副反响等长处被广泛用于肥壮症的医治，但其详细效果机制没有彻底明晰。刺鼠基因相关蛋白（AGRP）和神经肽Y（NPY）是重要的胃口调理因子，有增强胃口、促进摄食的效果，胰岛素则能够效果于下丘脑而按捺胃口，促进产热，该效果首要经过AGRP/NPY介导[1]。本试验经过查询电针对饮食诱导的单纯性肥壮（DIO）大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰岛素（FINS）和下丘脑AGRP、NPY基因表达的影响，评论电针医治肥壮症的相关机制。

1 试验资料

1.1 动物及饲料

SPF级4周龄SD大鼠50只，雄性，体质量约100 g，湖南斯莱克景达试验动物有限公司，许可证号43004700012177。养殖于湖南中医药大学试验动物中心SPF级试验室，操控室温为20～22 ℃，湿度30%～40%，自在饮水，昼夜替换12 h/12 h。低脂、高脂饲料，美国Research Diet公司。

1.2 药物

奥利司他胶囊，重庆植恩药业有限公司，批号20140412。

1.3 首要试剂与仪器

血糖试剂盒，罗氏公司，批号601404-01；125I胰岛素放射免疫剖析试剂盒，北京北方生物技能研讨所研发，批号201503；Trizol，美国 Invitrogen生命技能公司；SYBR Green qPCR Mix，日本TOYOBO公司；反转录试剂盒，Fermentas公司。华佗牌SDZ-V电针仪，姑苏医疗用品厂有限公司；华佗牌无菌针灸针，姑苏医疗用品厂有限公司，0.25 mm×13 mm；DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂；7300荧光定量PCR仪，美国ABI；RM2235轮转白腊切片机，德国徕卡。

2 试验办法

2.1 造模

试验大鼠适应性喂食1周后，随机分为低脂组10只和高脂组40只，别离喂饲低脂和高脂饲料。以高脂组大鼠体质量超过低脂组大鼠均匀体质量20%为成模规范。

2.2 分组及医治

将造模成功的DIO大鼠30只随机分为3组，一组不做任何医治为模型组，一组予以电针医治为电针组，一组予以奥利司他灌胃为西药组，每组10只。将电针组大鼠放入克己固定器中，依据《试验针灸学》[2]常用试验动物针灸穴道定位，取双侧“后三里”和“曲池”，一次性运用无菌针灸针别离刺入7 mm和4 mm，然后接通电针仪，选用频率10 Hz、强度1.5 mA、接连波，每次医治20 min，每日1次，接连28 d。西药组予奥利司他灌胃，成人每日临床用量为360 mg/d，按体表面积等效剂量换算比率，大鼠按1 mL/100 g核算灌胃量，每日灌胃1次，接连28 d。低脂组和模型组不予任何医治。医治期间，为确保试验前后可比性，低脂组予低脂饲料喂食，模型组、电针组和西药组仍予高脂饲料喂食。每日查询记载各组大鼠体质量、摄食饮水量、巨细便状况等。

2.3 选材

28 d后，各组大鼠禁食过夜，次日予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉，腹主动脉采血，3000 r/min离心10 min，别离血清待测。取肾周脂肪、肝脏右外叶，10%福尔马林固定。在冰上敏捷取出下丘脑，置于液氮中，-80 ℃冰箱保存。

2.4 目标检测

2.4.1 生化目标检测 使用血糖试剂盒和125I胰岛素放射免疫剖析试剂盒别离检测FPG和FINS含量。

2.4.2 病理查询 HE染色，经脱水通明、浸蜡包埋、切片和贴片、脱蜡染色、脱水通明和中性树胶封固等，镜下查询脂肪安排和肝脏标本并摄影。

2.4.3 RT-qPCR检测 ①引物规划。从NCBI中下载基因序列，引物规划选用Primer 5.0软件，引物序列别离为：NPY f- GTGTTTGGGCATTCTGGCTG，NPY r-GTGGGACAGGCAGACTGGTT，引物长度320 bp；AGRP f-TAGGCAAGGATCAACAAGCAA，AGRP r- TAGACCTGAGAACTCTGGGAA，引物长度161 bp；β-actin f-CCCATCTATGAGGGTTACGC，β-actin r- TTTAATGTCACGCACGATTTC，引物长度118 bp。②总RNA提取：每100 mg下丘脑标本参加1 mL Trizol液氮研磨，依据试剂盒提取样品总RNA，并测定RNA的纯度和浓度。③cDNA榜首链的组成。0.5 ?L OligodT（0.5 ?g/?L）和5.5 ?L Total RNA参加PCR小管中，弥补DEPC处理水至12 ?L；混匀后离心，65 ℃温浴5 min，当即置于冰上。按份额制造反响系统（冰上进行）：5×Reaction Buffer 2 ?L，RNase Inhibitor 0.5 ?L，10 mmol/L dNTPs 1 ?L，Reverse Transcriptase 0.5 ?L，混匀，时间短离心。上述系统在42 ℃反响1 h，然后在70 ℃水浴锅中水浴10 min使Reverse Transcriptase失活；将得到cDNA 置于-20 ℃保存备用。④RT-qPCR。按份额制造反响系统：2×SYBR Green qPCR Mix 10 ?L，上游引物（10 ?mol/L）1 ?L；下流引物（10 ?mol/L）1 ?L，cDNA 1 ?L，水7.0 ?L。设定程序为两步法Real-Time定量，预变性95 ℃、3 min，之后每一步变性95 ℃、10 s，58 ℃退火延伸30 s，共35个循环，每次在延伸阶段读取荧光值。用2-ΔΔCt法进行各基因表达的相对定量。

3 计算学办法

选用SPSS17.0计算软件进行剖析。试验数据以—x±s标明，多组间比较选用方差剖析，方差齐用LSD剖析，方差不齐用Dunnett T3剖析。P<0.05标明差异有计算学含义。

4 成果

4.1 电针对模型大鼠体质量的影响

造模前各组大鼠体质量无差异。造模后，模型组、西药组及电针组体质量显着高于低脂组（P<0.05）。医治4周后，西药组和电针组大鼠体质量显着低于模型组（P<0.05），但西药组和电针组比较差异无计算学含义（P>0.05）。成果见表1。

4.2 电针对模型大鼠空腹血糖、空腹胰岛素和胰岛素反抗指数的影响

电针组FINS、FPG显着低于模型组（P<0.05）；电针组和西药组胰岛素反抗指数（HOMA-IR=FINS×FPG÷22.5）显着低于模型组（P<0.05），但西药组和电针组比较差异无计算学含义（P>0.05）。成果见表2。

4.3 电针对模型大鼠下丘脑刺鼠基因相关蛋白、神经肽Y基因表达的影响

与低脂组比较，模型组AGRP、NPY基因表达水平显着升高（P<0.05）；与模型组比较，西药组和电针组AGRP、NPY基因表达水平显着下降（P<0.05），但西药组和电针组比较差异无计算学含义（P>0.05）。成果见表3。

4.4 电针对模型大鼠脂肪细胞、肝脏安排的影响

模型组大鼠脂肪细胞直径大于低脂组（P<0.05），而西药组和电针组脂肪细胞直径小于模型组（P<0.05），见表4、图1。光镜下，低脂组大鼠肝脏可见单个脂变肝细胞；模型组大鼠肝细胞体积增大，胞浆内脂滴巨细不一，脂变细胞达3/4以上，细胞水肿严峻，灶性炎细胞滋润；西药组和电针组较模型组脂变细胞在1/2以下，胞浆内脂滴变小，轻度水肿，无炎细胞滋润。各组大鼠肝脏病理变化见图2。

4.5 不良反响

西药组大鼠大便溏稀不成形，活动削减，精力萎靡，毛色枯黄；模型组大鼠大便尚可，活动量稍削减，毛色略黄；电针组和低脂组大便正常，毛色有光泽。

5 评论

关于单纯性肥壮症的医治，现在首要有药物疗法、针灸疗法、手术疗法和运动疗法等。自从曲美等一批盐酸西布曲明类药物下架后，奥利司他是现在国内仅有的合法瘦身药。该药可按捺胃肠道消化脂肪所需的酵素，而削减胃肠道对脂肪的吸收，但易导致脂肪代谢紊乱，表现为胃肠胀气、大便次数增多和脂肪便等[3]。在本试验中，咱们亦查询到西药组大鼠大便溏稀不成形、体毛枯黄，而电针组大鼠大便正常，毛色有光泽。

阳明经为多气多血之经脉，与能量代谢联系最为亲近，胃口的强弱直接与胃经和胃气相关，无论是临床实践仍是动物模型操作中，阳明经腧穴常被选为针刺干涉肥壮的主穴。因而本试验中，咱们挑选阳明经的“后三里”和“曲池”作为医治肥壮大鼠的腧穴。

在本试验中，电针组和西药组医治4周后，体质量显着低于模型组（P<0.05），医治期间体质量增加数值亦低于模型组（P<0.05），标明电针和奥利司他均可有用按捺DIO大鼠体质量的增加。

胰岛素是重要的能量调理因子，正常大鼠予下丘脑打针胰岛素可显着按捺摄食。下丘脑在胃口调理及摄食中起着关键效果，其间的弓状核含有许多调理胃口的神经肽，包含促进摄食的AGRP和NPY。弓状核上的AGRP和NPY神经元含有胰岛素受体。下丘脑的胰岛素经过与其受体结合后，发动相关转导信号，能够按捺AGRP和NPY神经元的表达[4]，到达下降胃口，增加产热和能量消耗的效果。但是流行病学查询标明，肥壮者存在着显着的胰岛素反抗[5]，高胰岛素血症是胰岛素反抗的一个首要标志[6]。肥壮者体内尽管存在着较高水平的胰岛素，却无法发挥其相应的效果。

研讨标明，减轻糖尿病患者的体质量能有用改进胰岛素反抗、下降血糖[7]。咱们在试验中也查询到，模型组胰岛素水平较低脂组升高，提示模型组大鼠或许存在胰岛素反抗。而电针医治4周后，电针组大鼠胰岛素水平较模型组显着下降（P<0.05），相应的HOMA-IR亦显着下降（P<0.05），阐明电针组大鼠的胰岛素反抗状况得到显着改进。一起，咱们查询到，模型组AGRP和NPY基因表达水平显着高于低脂组（P<0.05），而电针组其基因表达水均匀显着低于模型组（P<0.05）。提示电针组大鼠医治后胰岛素反抗的状况得到改进，增加了胰岛素的敏感性，经过与其受体结合，按捺了AGRP和NPY神经元的表达。

脂肪细胞体积增大是肥壮症的重要安排学特征。模型组大鼠脂肪体积增大，这与人类肥壮症的安排学改动相一致。医治4周后，电针组和西药组大鼠脂肪细胞直径显着变小，标明全体的脂肪代谢经调整后，脂肪安排结构发生了相应的改动，或许是其瘦身的重要形状学根底。病理查询成果显现，电针组和西药组大鼠肝安排脂肪病变较模型组显着减轻，标明2组皆可改进肝脏中脂质的含量。

本研讨成果标明，电针可经过改进胰岛素反抗状况，然后按捺促食因子AGRP和NPY神经元的基因表达，一起改动脂肪细胞巨细、改进肝脏脂变状况，而到达操控体质量增加的意图。电针对胰岛素及下丘脑NPY和AGRP基因表达的良性调整效果或许是电针瘦身的重要细胞分子效果机制。相较西药组大鼠表现出来的不良反响，电针是一种具有显着优势的抗肥壮医治办法。

参考文献：

[1] MAYER C M， BELSHAM D D. Insulin directly regulates NPY and AgRP gene expression via the MAPK MEK/ERK signal transduction pathway in mHypoE-46 hypothalamic neurons[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2009，307（1/2）：99-108.

[2] 余曙光，郭义.试验针灸学[M].上海：上海科学技能出版社，2009：150- 151.

[3] 马微，付丽，王海波，等.新式瘦身药奥利司他的研讨进展[J].华西药学杂志，2009，24（4）：431-433.

[4] BECK B. Neuropeptides and obesity[J]. Nutrition，2000，16（10）：916-923.

[5] BLOOMGARDEN Z T. Insulin resistance concepts[J]. Diabetes Care， 2007，30（5）：1320-1326.

[6] 潘时中.胰岛素反抗综合征的处理[J].高血压杂志，2000，8（2）：185-186.

[7] 夏欣，陈建峰，江海丽，等.对肥壮型2型糖尿病患者体重操控的中西医医治[J].辽宁中医药大学学报，2014，16（11）：73-76.