美赞臣乳蛋白部分水解配方粉 根据计算机辅佐水解和蛋白互作网络的珍珠母寡肽效果机制解析
陈艳昆 乔连生 霍晓乾 张栩 韩娜 张燕玲
[摘要] 珍珠母蛋白及活性肽是珍珠母發挥效果的首要成分之一，解析其药效物质及效果机制具有重要研讨含义。该研讨运用核算机辅佐水解和蛋白互作网络等模仿技能，取得珍珠母的活性寡肽成分，猜测其潜在的效果靶标并解析珍珠母寡肽的效果机制。经过搜集珍珠母的首要珍珠层蛋白序列，选用核算机辅佐水解办法进行蛋白的模仿消化水解，构建了包括458条珍珠母水解寡肽的三维结构数据库。随后运用反向找靶技能猜测珍珠母寡肽的效果靶点，并经过网络富集技能法对排名前20的要害靶点及其蛋白互作联系进行剖析，取得12个功用模块。从体系视点了解各种生物学进程，发现珍珠母寡肽的效果靶点与神经体系相关疾病有密切联系，提示珍珠母寡肽具有能医治中枢神经类相关疾病的成效。核算机辅佐水解办法可以高效地对已知序列结构的珍珠母蛋白进行模仿水解，并结合蛋白互作网络，解析珍珠母寡肽医治神经类疾病的效果机制。该研讨为评论中药寡肽类药效物质发现及效果机制解析的供给研讨思路，为展开寡肽类中药规划研讨供给了重要的技能支撑。
[要害词] 核算机辅佐水解； 珍珠母； 蛋白互作网络； 反向找靶； 药效团； 寡肽
Pharmacological mechanism analysis of oligopeptide from Pinctada fucata
based on in silico proteolysis and protein interaction network
CHEN Yankun， QIAO Liansheng， HUO Xiaoqian， ZHANG Xu， HAN Na， ZHANG Yanling*
（School of Chinese Material Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）
[Abstract] Pinctada fucata oligopeptide is one of key pharmaceutical effective constituents of P. fucata. It is significant to analyze its pharmacological effect and mechanism. This study aims to discover the potential oligopeptides from P. fucata and analyze the mechanism of P. fucata oligopeptide based on in silico technologies and protein interaction network（PIN）. First， main protein sequences of P. fucata were collected， and oligopeptides were obtained using in silico gastrointestinal tract proteolysis. Then， key potential targets of P. fucata oligopeptides were obtained through pharmacophore screening. The proteinprotein interaction（PPI） of targets was achieved and implemented to construct PIN and analyze the mechanism of P. fucata oligopeptides. P. fucata oligopeptide database was constructed based on in silico technologies， including 458 oligopeptides. Twelve modules were identified from PIN by a graph theoretic clustering algorithm Molecular Complex Detection（MCODE） and analyzed by Gene ontology（GO） enrichment. The results indicated that P. fucata oligopeptides have an effect in treating neurological diseases， such as Alzheimer′s disease. In silico proteolysis could be used to analyze the protein sequences of traditional Chinese medicine（TCM）. According to the combination of in silico proteolysis and PIN， the biological activity of oligopeptides could be interpreted rapidly based on the known TCM protein sequence. The study provides the methodology basis for rapidly and efficiently implementing the mechanism analysis of TCM oligopeptides.
[Key words] in silico proteolysis； Pinctada fucata； PIN； reverse target identification； pharmacophore； oligopeptidesendprint
珍珠母为珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pinctada fucata的贝壳，收录于《我国药典》2015年版，其味咸性寒，归肝、心经，具有平肝潜阳、安神定惊、明目退翳的成效[1]。作为我国的传统中药，珍珠母的临床运用始见于唐代陈藏器[2]的《本草拾遗》，“老蚌含珠，壳堪为粉。烂壳为粉，饮下，主反胃，胸怀间痰饮”。可见珍珠母的运用办法常为珍珠母粉末。现代研讨标明，珍珠母的有效成分不是占90%以上的碳酸钙，而是其间少数的有机酸及活性蛋白[3]。在用药进程中，珍珠母的活性蛋白可在肠道中经消化水解构成活性寡肽，然后被吸收入血，发挥药效。珍珠母寡肽具有较好的冷静、催眠、安神效果，多用于医治神经类的疾病[4]。
本研讨经过核算机辅佐蛋白水解技能，模仿消化道的消化酶组成，运用胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶一起虚拟水解[5]，取得包括2～6肽的珍珠母虚拟水解寡肽，构建虚拟结构数据库。随后运用反向找靶技能，取得珍珠母寡肽效果的潜在要害靶标。运用这些蛋白互作联系信息构建蛋白质彼此效果网络（protein interaction network，PIN），对网络进行功用模块剖析，以期从分子水平解析珍珠母寡肽医治神经类疾病的效果机制，为临床运用供给科学根据。
1 资料与办法
1.1 珍珠母蛋白的模仿水解及寡肽数据库构建 本研讨以马氏珍珠贝Pinctada fucata为检索词，经过在NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中对其所含的首要贮存蛋白质进行检索。研讨标明，珍珠母中所含蛋白质首要为马氏珍珠贝的珍珠层蛋白nacrein，N16与N19等[69]。
本研讨搜集其蛋白序列688條，其间包括有很多因为核苷酸多态性引起的多样性蛋白序列。本研讨选用BIOPEP（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index. php/pl/biopep）对取得的蛋白序列进行核算机辅佐模仿水解，以猜测珍珠层蛋白序列的切开位点。试验选用模仿胃肠道消化水解的战略，挑选胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶和糜蛋白酶作为消化酶一起虚拟水解。根据取得的切开位点进一步分化蛋白序列，挑选其间2～6肽的分子并运用Discovery Studio 4.0（DS）进行寡肽三维结构数据库的构建[10]。
1.2 珍珠母寡肽的反向找靶研讨 因为本文进行天然寡肽的模仿水解，因而挑选天然立体构型的氨基酸来构建寡肽分子，即L型氨基酸，最终经过Minimize ligands对寡肽分子进行能量最小化剖析，在CHARMm力场下加载MomanyRone电荷，选用最陡下降法和共轭梯度法相结合的能量优化算法，取得寡肽的最低能量构象。随后对寡肽分子进行多构象的生成，挑选BEST形式，生成255个构象，然后生成珍珠母寡肽三维结构数据库。本研讨根据DS软件中PharmaDB数据库的药效团模型，进行反向找靶研讨[1112]。查找办法挑选柔性查找，以匹配打分值0.9为截断值，核算每个靶标的打分值总和，然后点评珍珠母寡肽潜在的效果靶标，进一步构建其蛋白互作网络。
1.3 蛋白互作网络的构建 珍珠母寡肽的潜在效果靶标的蛋白质彼此效果信息来历于String数据库（http：//stringdb.org/）[13]，包括已知的和猜测的人源蛋白质彼此效果信息。在String中，对每一个蛋白彼此效果都有一个打分值，打分值越高，则数据越牢靠，本文选取打分值大于0.9且排名前20的高置信度的PPI数据，以保证成果的牢靠性。将取得的悉数蛋白彼此效果数据导入Cytoscape 3.4.0[14]软件，对每个靶点的蛋白互作网络进行union[15]核算，然后将独立的各个靶标的蛋白互作信息进行整合，去除孤立点、重复边和自环边，构建珍珠母寡肽的蛋白互作网络。
1.4 蛋白模块剖析 蛋白质经过彼此之间彼此效果结组成一个集体来完结其生物学功用，这些紧密联系的集体称之为蛋白复合体或功用模块。本研讨选用根据复合检测算法（MCODE）[16]对蛋白网络进行模块剖析。其间，决议辨认模块巨细的参数KCore设置为3，即至少包括4条边。并运用BinGO插件[17]对辨认出的模块进行功用注释，其间显著性挑选0.05，基因本位信息及注释信息均来自Gene Ontology （http：//www.geneontology.org/）。BinGO运用的核算查验办法为超几许查验，该查验办法用P标明一组基因归于同一基因本位的概率，P越小阐明一组基因归于同一基因本位的概率越大。本研讨对辨认取得模块的注释成果进行模块功用的剖析，有助于从体系视点了解各种生物学进程，解说珍珠母寡肽的效果机制。
2 成果与评论
2.1 珍珠母寡肽库的构建 本研讨对珍珠母珍珠层首要蛋白序列进行核算机水解猜测，针对其间具有较好的相对分子质量与成药性的2～6肽构建了包括458条珍珠母水解寡肽的数据库。其间各段寡肽的数目散布见图1。
2.2 反向找靶 经过DS软件的Ligand Profiler功用对得到的珍珠母层蛋白与PharmaDB数据库的药效团模型进行反向找靶。以匹配打分值0.9为截断值，核算每个靶标的打分值总和。截取打分值总和排名前20的靶标进行进一步剖析。要害靶点及对应的基因信息及打分值见表1。将挑选得到的要害靶点与珍珠母层蛋白进行彼此匹配，得到珍珠母与药效团的匹配热度图2。横坐标代表20个药效团模型，纵坐标代表458个寡肽。不同色度改变标明彼此效果不同，从蓝色到赤色，标明珍珠母寡肽与靶标的彼此效果逐步增强。
2.3 珍珠母寡肽蛋白互作网络 本研讨构建的珍珠母寡肽的蛋白互作网络见图3，包括251节点、1 112条边。根据MCODE办法对网络进行模块剖析，共取得12个功用模块，见图4，其间，运用BinGO对模块进行注释，取得的首要生物进程见表2。endprint
2.4 蛋白模块剖析 经过模块剖析，珍珠母寡肽首要参加的生物进程有G蛋白偶联受体信号通路、对影响的细胞应对、细胞有丝分裂周期间期、根据肾素血管严重素的动脉血压调理、β淀粉样蛋白代谢通路等。其间，与神经体系直接相关的模块包括模块1和模块12，与心血管体系直接相关的模块包括模块1、模块2、模块3和模块8，与细胞搬迁相关的模块包括模块9和模块10，与细胞应对相关的模块包括模块7和模块10。珍珠母具有平肝潜阳、安神定惊的传统成效[18]，与神经体系疾病相关。因而，本研讨针对G蛋白偶聯受体信号通路模块1和β淀粉样蛋白代谢通路模块12，评论珍珠母寡肽针对中枢神经类疾病的医治效果。
中心靶点之一。5HT2A介导的G蛋白偶联受体信号通路在调理中枢神经体系的功用中具有重要效果[19]，其与人类多种精力活动密切相关，是医治郁闷症、焦虑症、失眠等神经类疾病的要害靶点[20]。研讨标明5HT2A与mGluR的活性高度相关，mGluR可以调理5HT2A的活性，然后一起调控机体对神经振奋的反响[2122]。研讨发现[23]，低浓度的NPS经过直接效果于5HT2A来挑选性的按捺5HT的开释，然后影响机体在神经体系的活动。5HT2A水平下降导致的情志低迷对应的中医证型之一为心肾不交型，其症状多见心情郁闷，心悸，健忘，失眠多梦，烦躁多汗等[24]。《灵枢经·邪客》云：“心者，五脏六腑之大主也，精力之所舍也”，可见人的知道、精力、思维活动与心联系密切。针对这种中医证型，珍珠母具有杰出的治效果果[25]。珍珠母归心经，具有安神定惊的传统成效，临床上珍珠母可用于医治神经类疾病如惊悸怔忡、七上八下、失眠健忘等。《本草纲目》[26]中记载珍珠母可“安灵魂，止遗精白浊，解痘疗毒”。结合本试验的研讨成果，珍珠母寡肽可调理要害蛋白5HT2A的功用，提示珍珠母寡肽具有潜在的医治惊悸失眠，七上八下等神经类疾病的效果。
模块12代表的β淀粉样蛋白代谢通路，包括β排泄酶1（beta secretase 1，BACE1）、Nicastrin蛋白（nicastrin）和早老素1（presenilin1，PSEN1）等，与神经类疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）有密切联系。其间，BACE1是神经体系疾病的首要靶点之一，因其是生成β淀粉样蛋白（Aβ）进程中的要害限速酶。Aβ的堆积被认为是导致神经元损伤的重要原因。本试验发现，珍珠母寡肽可经过效果于BACE1发挥效果。BACE1敲除的小鼠不能发生Aβ，且小鼠生理及解剖学健康不受影响，因而BACE1是医治神经类疾病AD的潜在重要靶标[27]。Nicastrin[28]和PSEN1[29]均为γ排泄酶的重要组成部分，而γ排泄酶可以促进Aβ的发生。因而，对Nicastrin和PSEN1功用的知道和了解可能为γ排泄酶及AD相关药物开发带来新的知道。AD在中医学中归于“呆病”，肝阳上亢型为AD的首要证型之一，症状多见烦躁易怒，头晕健忘等。针对这种AD的证型，平肝潜阳法为其首要治法[30]。珍珠母归肝经，具有平肝潜阳，重镇安神之成效。《饮片新参》[31]中记载珍珠母可“平肝潜阳，安神魂，定惊痫。”《我国医学大辞典》中记载珍珠母“入肝经，可滋肝阴，清怒火，治癫狂惊痫，头眩等”。结合本试验研讨，进一步发现珍珠母寡肽可调理要害蛋白BACE1发挥效果，然后发挥调理中枢神经体系类疾病如AD的药效，有助于部分提醒珍珠母寡肽的效果机制。
3 定论
本研讨根据核算机辅佐水解办法，对珍珠母中的蛋白质进行模仿消化水解，取得并构建了包括458个珍珠母寡肽三维结构数据库。随后，运用反向找靶技能，对珍珠母寡肽效果的前20个效果靶标进行网络富集及蛋白彼此效果的剖析，发现了12个功用模块。这些功用模块与神经体系、心血管体系、细胞搬迁与应对等有关。其间，5HT2A介导的G蛋白偶联受体信号通路模块和β淀粉样蛋白代谢通路模块与神经体系直接相关。模块中的珍珠母寡肽效果的要害蛋白如5HT2A和BACE1等可以调理神经内排泄、郁闷、冷静、焦虑以及AD等疾病的进程，提示珍珠母寡肽可以医治失眠、焦虑、AD等疾病。关于本文的研讨成果，还需求进一步剖析珍珠母寡肽是否能吸收入血，一起寡肽化合物活性需求进行生物试验验证。本文经过联合核算机辅佐水解技能和蛋白互作网络办法，阐释珍珠母寡肽医治中枢神经类疾病的效果机制。一起也为评论快速、高效展开中药来历的肽类物质的活性机制研讨供给了办法学根据。
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[责任编辑 张宁宁]endprint