海马神经元 苦参素经过p38/JNK信号途径对海马神经元凋亡的影响

蔡艳+蒋伟+周爱玲+赵敏+徐玲

[摘要] 评论苦参素（oxymatrine，OMT）对海马神经元凋亡的影响及其机制。选用MTT法测定OMT对海马神经元存活率的影响；生物化学法测定OMT对LPS诱导的海马神经元乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）开释率的影响；Hochest 33342染色调查海马神经元凋亡形状；实时定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）办法检测海马神经元中Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA的表达；蛋白免疫印迹法（Western blot，WB）检测海马神经元中p38，p-p38，JNK，p-JNK，Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达。成果发现，不同剂量的OMT（0.37～6.0 g·L-1）和海马神经元共培育24 h，海马神经元成长状况杰出；LPS影响后，海马神经元LDH开释率添加（P<0.01），JNK和p38的磷酸化水平显着添加（P<0.01），Bax/Bcl-2的份额及Caspase-3的表达上调（P<0.01），海马神经元凋亡添加。OMT预处理后，能显着下降海马神经元经LPS影响后的LDH开释（P<0.05或P<0.01），削减p38和JNK磷酸化水平，下降Bax/Bcl-2的份额及Caspase-3的表达（P<0.01），海马神经元凋亡削减。综上，OMT能下降经LPS激活的p38和JNK磷酸化水平，下调Bax/Bcl-2的份额和Caspase-3的表达，然后按捺海马神经元凋亡。OMT经过p38/JNK信号途径按捺海马神经元的凋亡。

[关键词] 苦参素； 海马神经元； 细胞凋亡； p38/JNK

[Abstract] To investigate the effect and mechanism of oxymatrine（OMT） on hippocampal neurons apoptosis. Effect of OMT on survival of hippocampal neurons was measured by MTT.Effect of OMT on LPS-induced lactate dehydrogenase（LDH） release rate in hippocampal neurons was measured by biochemical methods. Hoechst 33342 staining was used to observe the apoptotic morphology of hippocampal neurons.The mRNA expression levels of Bax， Bcl-2， and Caspase-3 were detected by Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）， and the protein expression levels of p38， p-p38， JNK， p-JNK， Bax， Bcl-2 and Caspase-3 were detected by Western blot.The results showed that， hippocampal neurons all grew well after treatment by different doses （0.37-6.0 g·L-1） of OMT for 24 h. Stimulation from LPS increased the release of LDH（P<0.01）， improved the JNK and p38 phosphorylation levels（P<0.01）， increased the proportion of Bax/Bcl-2 and the expression of Caspase-3（P<0.01）， and promoted the apoptosis of hippocampal neurons. OMT pretreatment could significantly reduce the release of LDH induced by LPS stimulation（P<0.05 or P<0.01）， reduce the p38 and JNK phosphorylation， decrease the expression of Caspase-3 and Bax/Bcl-2（P<0.01）， and diminish the apoptosis of hippocampal neurons.In conclusion， OMT could reduce the LPS-induced phosphorylation of p38 and JNK， down-regulate the Bax/Bcl-2 ratio and expression of Caspase-3， thus inhibiting apoptosis of hippocampal neurons. The mechanism may be associated with p38/JNK signaling pathway.

[Key words] oxymatrine； hippocampal neurons； apoptosis； p38/JNK

神經退行性疾病（neurodegenerative disease，ND）是一类缓慢、进行性神经系统疾病，神经细胞退行性病变是它们的一起特色。在大多数ND中，尤其是阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD） 特征性病理改变之一是脑内神经元数目显着削减，以海马区和基底前脑劳累最为严峻，神经元削减均匀可达47%。近年来以为细胞凋亡（apoptosis）是引起AD神经元数目削减的重要原因[1-3]。

但是，现在尚无有用的药物阻挠或按捺AD脑安排中神经元的凋亡。苦参素（oxymatrine，OMT）是从苦参、苦豆子及广豆根中别离提纯出来的生物碱，具有四环的喹嗪啶结构，药理和临床试验证明，OMT可削减多种炎症因子的活化，具有抗凋亡的药理效果[4]。本课题组前期研讨发现，OMT 能显着按捺由LPS诱导的大鼠脑内炎症反响，维护神经元[5]。但对神经退行性疾病如AD神经元凋亡的影响及其机制未见报导。

本项目以非甾体抗炎药阿司匹林（aspirin/acetylsalicylic acid，ASA）为阳性药对照[6]，使用不同剂量的OMT别离预处理海马神经元，再用LPS影响海马神经元，运用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot，WB）等办法评论OMT经过p38/JNK信号途径对海马神经元凋亡的影响及其或许机制。经过上述研讨，希望在理论上为OMT在按捺海马神经元凋亡效果方面供给更多的试验依据。

1 资料

1.1 动物 重生1 d的SD大鼠，SPF级，由南通大学试验动物中心供给，许可证号SYXK（苏）2012-0031。

1.2 仪器 细胞培育板（Corning 公司，美国）；细胞培育箱（Jouan公司，法国）；超净工作台（姑苏华宏净化技能有限公司）；各种类型的移液器（Eppendorf公司，德国）；XDS-1B倒置生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）；PTC-100 PCR仪（美国Bio-Rad公司）；Eppendorf核酸蛋白剖析仪（德国Eppendorf公司）；Elx800全自动酶标仪（美国宝特仪器有限公司）；Mini protein-3电泳装置（美国Bio-Rad公司）；DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；电热恒温干燥箱（上海华联环境试验设备公司恒温仪器厂）；电热恒温水槽（上海华联环境试验设备公司恒温仪器厂）；PB-10 pH计（北京塞多利斯公司）；TY-80S脱色摇床（南京新学校生物技能研讨所）。

1.3 药品与试剂 苦参素（宝鸡市方晟生物开发有限公司，批号F20110322），MTT（Fluka公司），LPS（Sigma，USA），BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（海门碧云天生物技能研讨所，编号P0010S），十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulphate，SDS）（国药集团化学试剂有限公司，批号F20080521），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜（MILLIPORE），预染蛋白质规范（Fermentas，批号00067755），SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（Fermentas，批號00066150），GENMED 乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒 （GENMED SCIENTIFICS INC.U.S.A，编号GMS10073v.A），兔抗Caspase-3多克隆抗体（rabbit anti-Caspase-3 polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），兔抗Bax多克隆抗体（rabbit anti-Bax polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），兔抗Bcl-2多克隆抗体（rabbit anti-Bcl-2 polyclonal antibody，Santa Cruz，USA），鼠抗β-actin单克隆抗体（mouse anti-β-actin monoclonal antibody，Santa Cruz，编号sc-81178），JNK Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，3496-1），JNK Phospho Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，2155-1），p38 MAPK Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，1544-1），p38 MAPK Phospho Rabbit Monoclonal Antibody （Epitomics，1229-1），Trizol reagent（Invitrogen），PCR引物由上海睿强生物科技有限公司规划和组成（表1）。

2 办法

2.1 OMT对海马神经元存活率的影响 原代培育大鼠海马神经元悬液，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于96孔培育板中培育7 d左右，分为正常对照组和不同质量浓度的OMT（0.37，0.75，1.5，3.0，6.0 g·L-1）[7]组。吸去各组的培育基，不同浓度的OMT组：为含有相应浓度OMT的培育基，正常对照组换为等体积的培育基，孵育24 h，用MTT法检测各组海马神经元的存活率。

试验进程：吸去96孔板的细胞原培育液，每个孔参加25 μL MTT，37 ℃孵育4 h后弃去上清液，每孔参加100 μL 20%SDS溶液，37 ℃孵育24 h，570 nm波利益测定其吸光度。以正常对照组的细胞生机为100%，核算各试验组细胞的存活百分率。细胞存活率=（给药组的细胞生机÷正常对照组的细胞生机）×100%。试验重复6次。

2.2 不同浓度OMT预处理对LPS诱导的海马神经元LDH开释率的影响 把海马神经元接种于96孔培育板培育7 d左右，分为正常对照组和不同浓度的OMT（0，0.37，0.75，1.5，3.0，6.0 g·L-1）预处理组。不同浓度的OMT预处理组：依据前期研讨成果及参阅文献办法[7-8]，选用含有相应浓度OMT的培育基孵育3 h后，再参加终质量浓度为10 mg·L-1的 LPS效果24 h，正常对照组参加等体积的培育基，用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒测定各组海马神经元的LDH的开释量。具体进程参阅LDH试剂盒说明书，试验重复6次。

2.3 Hochest 33342染色调查海马神经元凋亡形状 试验分组：①正常对照组（仅参加培育基）；②LPS组（10 mg·L-1）；③ASA（5.0 mmol·L-1）[9]+LPS（10 mg·L-1）组（阳性药对照组）；④OMT中剂量（1.5 g·L-1）+LPS（10 mg·L-1）组。具体进程如下：于玻片大将培育7 d的海马神经细胞，选用OMT预处理3 h 后，参加终浓度为10 mg·L-1的LPS，效果24 h。取出玻片进行免疫荧光化学染色，进行冲刷。4%多聚甲醛4 ℃固定。10%山羊血清室温关闭1 h弃血清，再次冲刷。Hoechst 33342（1∶1 000稀释）室温15 min，ddH2O冲刷。用抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下调查细胞核形状学的改变，进行凋亡核计数并随机摄影。

2.4 RT-qPCR法检测OMT预处理对LPS诱导的海马神经元Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA的表达改变 原代培育大鼠海马神经元，试验分红7组：①正常对照组（Normal组，仅参加培育基）；②脂多糖组（LPS组，10 mg·L-1）；③阿司匹林+脂多糖组（ASA+LPS组，5.0 mmol·L-1+10 mg·L-1）；④苦参素组（OMT，1.5 g·L-1）；⑤苦参素低剂量+脂多糖组（OMT-L+LPS组，0.75 g·L-1+10 mg·L-1）；⑥苦参素中剂量+脂多糖组（OMT-M+LPS组，1.5 g·L-1+10 mg·L-1）；⑦苦参素高剂量+脂多糖组（OMT-H+LPS组，3.0 g·L-1+10 mg·L-1），提取细胞总RNA用于Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA测定。依照文献办法操作[10]。

2.5 Western blot 法检测OMT预处理对LPS诱导的海马神经元p38，p-p38，JNK，p-JNK，Bax，Bcl-2及Caspase-3的表达改变 取原代培育7 d的细胞，换成无血清培育基，试验分组同RT-qPCR法，蛋白质浓度用BCA法检测，蛋白印迹成果重复3次，用ImageJ软件进行灰度剖析，GraphPad Prism 5软件剖析计算各组特异性蛋白质表达量（均以β-actin为内参）。

2.6 数据处理与计算剖析 试验数据用±s表明，用GraphPad Prism 5计算软件进行方差剖析和两两比较，对数据进行计算学剖析，以P<0.05为有计算学含义。

3 成果

3.1 OMT对海马神经元存活率的影响 以对照组细胞生机为100%，按公式核算出各组细胞存活率。成果可见，与对照组比较，不同浓度的OMT各给药组之间没有显着计算学差异。成果显现不同浓度的OMT（0.37～6.0 g·L-1）和海马神经元共培育24 h，海马神经元成长状况比较好。

3.2 不同浓度OMT预处理对LPS诱导的海马神经元LDH开释率的影响 调查不同浓度的OMT对LPS诱导的海马神经元的毒性（LDH开释率）效果。成果可见，与对照组比较，LPS组的海马神经元的LDH开释率显着增大（P<0.01）。与LPS组比较，不同浓度的OMT可以显着下降LPS诱导的海马神经元的LDH开释率（P<0.05或P<0.01），且在必定浓度范围内跟着OMT浓度的增大，下降LDH开释率的效果呈增大趋势。但OMT在低质量浓度0.37 g·L-1削减LPS诱导LDH开释率相对较弱，而OMT在3.0，6.0 g·L-1时LDH开释率没有显着计算学差异。因而，本试验挑选OMT为0.75，1.5，3.0 g·L-1进行后续试验，见图1。

3.3 Hochest 33342 染色调查各组海马神经元凋亡形状 各组海马神经元Hoechst 33342染色，成果显现正常的海马神经元核为圆形或许卵圆型，染色均匀。而一部分神经元核呈洼陷状或碎块状，染色不均或许浓染，或许为凋亡细胞。与正常对照组比较，LPS组凋亡细胞相对较多。与LPS组比较，ASA+LPS组和OMT+LPS组凋亡细胞显着削减，见图2。

3.4 Western blot法检测各组海马神经元p-38及p-p38蛋白的表达 对照组海马神经元中p38磷酸化蛋白表达相对较少。与对照组比较，LPS组p38磷酸化蛋白的表达显着上调（P<0.01）。与LPS组比较，ASA+LPS组可以显着下降LPS诱导的p38磷酸化蛋白表达的增高（P<0.01）；各剂量OMT+LPS组能削弱LPS诱导的p38磷酸化蛋白表达的效果，且在必定的剂量范围内随OMT的剂量增大，效果增强（P<0.05或P<0.01），见图3。

3.5 Western blot法检测各组海马神经元JNK及p-JNK蛋白的表达 对照组海马神经元中JNK磷酸化蛋白表达相对较少。与对照组比较，LPS组JNK磷酸化蛋白的表达显着上调（P<0.01）；OMT组与对照组比较，JNK磷酸化蛋白表達没有显着计算学含义。与LPS组比较，ASA+LPS组JNK磷酸化蛋白表达显着下调（P<0.01）；各剂量OMT+LPS组可以显着下降LPS诱导的JNK磷酸化蛋白表达的增高（P<0.05或P<0.01），且在必定剂量范围内跟着OMT剂量增大，JNK磷酸化蛋白的表达逐步削减，见图4

3.6 RT-qPCR检测各组海马神经元中Bax，Bcl-2mRNA的表达改变 与对照组比较，LPS组Bax/Bcl-2 mRNA的份额显着增高（P<0.01）。与LPS组比较，ASA+LPS组Bax/Bcl-2 mRNA的份额显着下降（P<0.01）；各剂量OMT+LPS组Bax/Bcl-2 mRNA的份额显着低于LPS组（P<0.01），见图5。

OMT+LPS组在必定的剂量范围内随OMT剂量的增大，Bax/Bcl-2份额和Caspase-3蛋白的表达呈递减趋势，具有计算学含义（P<0.01），见图7。

3.7 RT-qPCR检测各组海马神经元中Caspase-3 mRNA的表达改变 对照组海马神经元中Caspase-3 mRNA的表达相对较少。与对照组比较，LPS组Caspase-3 mRNA表达显着增多（P<0.01）。与LPS组比较，ASA+LPS组可以显着下降LPS诱导的Caspase-3 mRNA的表达增多，且具有计算学含义（P<0.01）；各剂量OMT+LPS组在必定剂量范围内跟着OMT剂量的增大，其下降LPS诱导的海马神经元中Caspase-3 mRNA表达增多的效果也逐步增强。（P<0.05或 P<0.01），见图6。

3.8 Western blot法检测各组海马神经元中Bax，Bcl-2及Caspase-3蛋白的表达 对照组中，Bax/Bcl-2份额和Caspase-3蛋白的表达比较少。与对照组比较，LPS组Bax/Bcl-2份额和Caspase-3蛋白的表达显着上调（P<0.01）；OMT组Bax/Bcl-2份额和 Caspase-3蛋白的表达没有显着计算学差异。与LPS组比较，ASA+LPS组可以显着下调Bax/Bcl-2份额和Caspase-3蛋白的表達（P<0.01）；各剂量OMT+LPS组在必定的剂量范围内随OMT剂量的增大，Bax/Bcl-2份额和Caspase-3蛋白的表达呈递减趋势，具有计算学含义（P<0.01），见图7。

4 评论

阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩性脊髓侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和帕金森综合征（Parkinson′s syndrome，PD）等神经退行性疾病，在海马区和基底前脑等脑安排的神经元发作了凋亡。但现在尚无有用药物阻抑神经元的凋亡。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏等药理效果[11] ，可按捺核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB），下降多种炎症因子的活化，具有抗凋亡的药理效果。

但是，OMT对海马神经元凋亡的影响及其机制尚不清楚。

4.1 OMT能下降海马神经元LDH 开释率按捺细胞凋亡 OMT预处理对LPS诱导的海马神经元LDH开释率成果显现，LPS对海马神经细胞膜有毒性效果，OMT在恰当的剂量范围内，能显着削减LPS诱导的LDH开释率，对海马神经细胞膜有维护效果。Hochest染色法成果可见，LPS影响后对海马神经元的毒性效果引起了细胞凋亡；OMT预处理可以显着按捺LPS诱导的海马神经元凋亡。

4.2 OMT能下降LPS诱导的海马神经元JNK和p38磷酸化水平 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一类丝/苏氨酸残基的蛋白激酶。MAPK的效果是将信号从细胞外表转导到细胞核内的十分重要传递者。MAPK信号转导通路中首要有，p38通路、c-Jim氨基结尾激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路、细胞外信号调理蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK） 通路。p38现已被证真实PC12和小脑颗粒细胞的凋亡调控的进程中有着非常重要的效果，并且p38在被胰岛素预处理过培育的重生神经细胞中将会失活[12-13]。p38被磷酸化，表明晰p38激活。JNK途径的激活参加了不同影响所造成的凋亡的发动。JNK激活不只参加了药物诱导的凋亡，并且参加了一些DNA损害影响引起的凋亡[14]。JNK的磷酸化产品p-JNK标志着JNK激活。ERK 信号通路在神经细胞凋亡中具有两层效果，即既有抗凋亡效果，也有促进凋亡效果，因其效果的复杂性，故本试验选用了LPS剌激海马神经元，Western blot检测p38，JNK及其磷酸化蛋白的表达改变。LPS能显着上调p38和JNK磷酸化蛋白的表达，p38和JNK被激活，然后促进海马神经元的凋亡。各剂量OMT预处理可以显着下降LPS诱导的海马神经元JNK和p38磷酸化水平，然后按捺海马神经元凋亡。OMT按捺LPS诱导的海马神经元凋亡与下降p-JNK，p-p38有关。

4.3 OMT预处理能下降海马神经元Bax/Bcl-2的份额及Caspase-3的表达 OMT能下降p-JNK与p-p38的表达，然后又经过何种机制按捺LPS诱导的海马神经元凋亡？近年来研讨发现，JNK能介导多种细胞外影响引起细胞凋亡，参加了多种细胞凋亡的发作[15]。活化后的JNK有一部分存在于细胞质内，可以经过磷酸化效果直接调理Bcl-2宗族成员（Bim，Bax，Bcl-2等）的活性，然后诱导线粒体途径的细胞凋亡[16] 。在Bcl-2宗族成员中，Bax在线粒体细胞凋亡途径中发挥着首要效果。活化的JNK一方面可以磷酸化激活Bax，Bim等，一起又可以按捺Bcl-2等抗凋亡蛋白。活化的Bax移位至线粒体外膜，使线粒体膜通透性增高开释Cyt C，Smac/DIABLO及凋亡诱导因子等促进凋亡的线粒体蛋白[17]。开释到细胞质中的Cyt C与凋亡酶激活因子-1（Apaf-1）等结合构成凋亡复合体，然后诱导Caspase依靠的线粒体途径的细胞凋亡。激活后的p38可以活化Caspase-3， 发动细胞凋亡信号通路，活化的Caspase-3又进一步切开不同的底物，使蛋白酶级联反响不断扩大，促进细胞凋亡。Liu等研讨发现磷酸化的p38还可以上调Fas/FasL，引起Caspase-3活化，以为p38在细胞凋亡进程中发挥了两层效果，但细胞的凋亡终究都是经过活化Caspase-3完结的[18]。

Bcl-2基因宗族包含两大类：一类是凋亡按捺基因：Bcl-2，Bcl-x1等；另一类是促凋亡基因：Bax，Bak等，Bax蛋白具有对立Bcl-2蛋白按捺凋亡的效果，Bax与Bcl-2在体内经过结合构成二聚体而发挥效果。当Bax与Bcl-2表达相平衡时，细胞的存活期正常；当Bcl-2高表达，而Bax的表达未相应增多时，Bax与Bcl-2构成异型二聚体发挥效果，按捺凋亡的发作，细胞的存活期延伸；当Bax高表达，而Bcl-2构成同型二聚体，发动Caspase酶系级联反响促进细胞凋亡。因而，Bax/Bcl-2比值的改变较单一的Bax或许Bcl-2的表达更牢靠和灵敏，更可以作为检测细胞是否发作凋亡的目标之一。

综上所述，LPS经过上调海马神经元p38和JNK磷酸化蛋白水平，p38和JNK被激活，使Bax/Bcl-2的份额和Caspase-3表达添加，然后促进海马神经元的凋亡。各剂量OMT预处理可以显着下降LPS诱导的海马神经元JNK和p38磷酸化水平，使Bax/Bcl-2的份额和Caspase-3表达削减，然后按捺海马神经元凋亡。

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