纳米鼻腔疫苗渠道 PLA—α—细辛脑纳米粒经鼻腔、静脉给药后药物动力学研讨
陆瑾+郭立玮+付廷明+朱国龙+戴真南+展冠军+陈丽丽
[摘要] 选用乳化溶剂挥发法制备聚乳酸（PLA）-α-细辛脑纳米粒，并与静脉打针给药比较，研讨PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后药物的体内散布及脑安排的靶向性。成果显现：鼻腔给药和静脉打针后的脑靶向系数别离为1.65与1.16，PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后的肯定生物利费用为74.2%，脑靶向功率为142.24%，鼻-脑传递百分比为29.83%。荧光符号法显现，PLA-α-细辛脑荧光纳米粒经鼻腔给药后，香豆素-6在脑安排中的荧光强度最大，抵达脑靶向给药的意图；PLA-α-细辛脑荧光纳米粒静脉打针给药后，香豆素-6在肝安排中的荧光强度远高于鼻腔给药，标明PLA-α-细辛脑纳米粒经鼻腔给药可下降药物导致的肝毒性。此外，PLA-α-细辛脑荧光纳米粒经鼻腔给药后，香豆素-6在肺安排中的荧光强度较弱，处理了气流破坏法制备的α-细辛脑干粉经鼻腔给药抵达肺部量较多的缺陷。体内研讨标明：与静脉打针比较，PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后的脑靶向性优于静脉打针。
[关键词] PLA-α-细辛脑纳米粒； 鼻腔； 药物动力学； 脑靶向
[Abstract] PLA-α-asarone nanoparticles were prepared by using organic solvent evaporation method， and their in vivo distribution and brain targeting after intranasal administration were studied as compared with intravenous administration. The results showed that brain targeting coefficient of PLA-α-asarone nanoparticles after intranasal and intravenous administration was 1.65 and 1.16 respectively. The absolute bioavailability， brain-targeting efficiency and the percentage of nasal-brain delivery of PLA-α-asarone nanoparticles were 74.2%， 142.24 and 29.83%， respectively after intranasal administration. The results of fluorescence labeling showed that the fluorescent intensity of coumarin-6 in the brain tissue was the highest after intranasal administration of PLA-α-asarone fluorescent nanoparticles， achieving the purpose of brain-targeted drug delivery. The fluorescent intensity of coumarin-6 in liver tissue after intravenous administration of PLA-α-asarone nanoparticles was much higher than that after intranasal administration， indicating that intranasal administration of PLA-α-asarone nanoparticles could decrease drug-induced hepatotoxicity. In addition， the fluorescent intensity of coumarin-6 in lung tissue was weaker after intranasal administration， which solved the shortcomings of intranasal administration of α-asarone dry powder prepared by airflow pulverization method. In vivo studies indicated that PLA-α-asarone nanoparticles after intranasal administration had a stronger brain targeting as compared with intravenous administration.
[Key words] PLA-α-asarone nanoparticles； intranasal； pharmacokinetic； brain targeting
α-細辛脑是天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的首要活性成分之一，研讨报导：α-细辛脑通过效果于NO水平医治阿尔茨海默病[1]，通过按捺海马神经元的活性及γ-氨基丁酸（GABA）受体的表达[2]医治癫痫，一起其可透过血脑屏障。因而，α-细辛脑具有医治中枢性神经体系疾病的远景。现在，α-细辛脑首要有2种给药办法，以胶囊剂或片剂的办法给药，生物利费用别离仅有2.73%，5.56%[3]；若选用静脉打针给药，因为α-细辛脑较高的脂溶性使其在制备进程中参加了吐温、丙二醇等助溶剂，而吐温、丙二醇等助溶剂又是导致细辛脑打针液过敏性休克等严峻不良反响的重要原因之一[4-5]。
纳米粒作为胶态药物载体具有小粒子的特征，能够穿过生物膜屏障，有的乃至可防止网状内皮体系吞噬，在不添加药物向血液转运的状况下可促进药物由鼻至脑的直接转运，然后进步药物的脑内浓度[6-8]。本课题组将α-细辛脑通过乳化溶剂挥发法将其制备成PLA-α-细辛脑纳米粒，并对其进行了表征及鼻黏膜毒性的研讨[9]。为点评药物在体内的靶向性，本研讨选用与静脉打针比照的办法，进一步研讨PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后α-细辛脑在体内的散布状况。
1 资料
SM-1000D超声波细胞破碎仪（南京舜玛仪器设备有限公司）；HJ-6A六联数显控温磁力拌和器（江苏金运市金城国胜试验仪器厂）；-70 ℃超低温冰箱（海尔）；Allegra 64R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；I-6冷冻干燥机（Ehrisa公司）；LibrorAEL-40SM 1/10万电子天平（岛津）；微型移液器（Eppendor公司）；MTN-2000W氮气浓缩仪（奥特赛恩斯仪器有限公司）；KQ3200医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；50 μL微量进样针（济南赛畅科学仪器有限公司）；WH-90A型微型混合器（上海亚荣生化仪器厂）；E6/10-8G型超细匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱体系，XevoTM TQ质谱体系（美国Waters公司）； ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；CRi Maestro IN-VIVO Imaging System小动物活体成像体系（美国）。
α-细辛脑对照品（我国食品药品检定研讨院，批号100298-201203）；吲哚美辛对照品（我国食品药品检定研讨院，批号100258-200904）；α-细辛脑原料药（湖北艺康源化工有限公司，批号130104，纯度>98%）；聚乳酸（PLA，相对分子质量1万，批号14011105，山东医疗器械研讨所）；聚乙烯醇1788（polyvinyl alcohol，PVA1788，上海阿拉丁试剂有限公司）；香豆素-6（coumarin-6，Sigma-Aldrich）；甲醇（色谱纯，Merck），冰醋酸（美国ROE scientific INC.，HPLC），正丁醇（上海中试化工总公司，AR，20090423），水为重蒸水，丙酮、二氯甲烷为剖析纯。
Sprague Dawley（SD）大鼠，体重200～250 g，雄性，SPF级（上海西普尔-必凯试验动物有限公司），许可证号SCXK（沪）2008-0016。大鼠养殖在SPF级的环境下，温度18～26 ℃，相对湿度40%～70%，12 h光照/漆黑替换，试验前自在饮水饮食。
2 办法
2.1 PLA-α-细辛脑纳米粒制备
精细称取一定量α-细辛脑原料药和PLA溶于10 mL的有机溶剂（二氯甲烷-丙酮=9∶1）中，配制成PLA质量浓度为14.76 g·L-1，α-细辛脑药物质量浓度为4.89 g·L-1的有机相，将有机相用打针器慢慢注入20 mL不断拌和的浓度为1%的PVA水溶液中，滴毕，持续拌和2 min后于超声波细胞破碎仪在600 W功率下超声4 min，磁力拌和器拌和6 h以上挥去有机溶剂后，5 000 r·min-1预离心5 min除掉沉积，离心液再以21 000 r·min-1离心45 min得纳米粒沉积，该沉积用重蒸水洗刷2次以除掉PVA，适量水涣散，冷冻干燥48 h得粉末状样品。临用前运用重蒸水配成10 g·L-1及50 mg·L-1的混悬液，别离供鼻腔给药及尾静脉打针。通过该办法制备得到的PLA-α-细辛脑纳米粒均匀粒径为265.4 nm，PDI指数0.038，载药量12.40%，包封率55.86%。
2.2 PLA-α-细辛脑荧光纳米粒制备
参照2.1项下办法，在PLA-α-细辛脑荧光纳米粒制备进程中除有机相中参加0.1%的香豆素-6，其他进程同2.1。
2.3 给药办法与剂量
2.3.1 PLA-α-细辛脑荧光纳米粒血药动力学研讨 12只SD大鼠随机分红2组，每组6只，别离进行PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药及尾静脉打针。试验前禁食（不由水）12 h。鼻腔给药办法如下：大鼠乙醚吸入麻醉后仰卧姿态放置，给药前将40 μL质量浓度为10 g·L-1PLA-α-细辛脑纳米粒混悬液吸入微量进样针，微量进样针前端套上塑料皮管对鼻腔进行维护，将微量进样针前端刺进大鼠鼻腔，深度不超越8 mm，2个鼻孔别离给药20 μL，整个给药进程在麻醉后1 min内完结。静脉给药办法如下：大鼠乙醚吸入麻醉后装入静脉打针笼，静脉打针器吸入约0.8 mL质量浓度为50 mg·L-1的PLA-α-细辛脑纳米粒进行尾静脈打针，一切大鼠均匀给药剂量约为1.6 mg·kg-1（该剂量是依据α-细辛脑纳米粒混悬液最大浓度以及大鼠鼻腔液体给药量而定），该给药剂量也与文献[10]根本共同。
2.3.2 PLA-α-细辛脑荧光纳米粒脑药动力学研讨 48只SD大鼠随机分红2组，每组24只。给药办法与剂量同2.3.1，进行PLA-α-细辛脑纳米粒静脉打针与鼻腔给药后脑药动力学研讨。
2.3.3 PLA-α-细辛脑荧光纳米粒的药代动力学研讨 24只SD大鼠随机分红2组，每组12只。给药办法同2.3.1，依据香豆素-6在纳米粒中的含量，将荧光纳米粒配制成恰当的浓度供大鼠鼻腔给药和尾静脉打针（香豆素-6的含量为10 μg）。
2.4 样品收集与处理
2.4.1 血药动力学研讨样品收集与处理 鼻腔给药和尾静脉打针后别离于给药后1，3，5，10，15，30，45，60，90，120，180，240 min眼眶后静脉丛取血0.5 mL，置于肝素钠抗凝管中，3 500 r·min-1离心15 min，别离血浆，于-70 ℃冰箱冷冻保存待测。检测前，取出血浆至室温冻结后，精细汲取150 μL于洁净离心管中，参加20 μL质量浓度为1 mg·L-1吲哚美辛[11]内标液后，再参加1 000 μL水饱满正丁醇，微型混合器涡旋3 min进行萃取，14 000 r·min-1离心10 min，取800 μL上清液至另一洁净的离心管中，在40 ℃的水浴顶用氮气浓缩仪吹干，残渣参加100 μL复溶液（0.1%甲酸水-甲醇6∶4），涡旋2 min后，14 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样5 μL剖析。
2.4.2 脑药动力学研讨样品收集与处理 给药后每组别离于5，15，30，45，90，180 min处死4只大鼠，从头盖骨下取出全脑安排，一切样品于-70 ℃冷冻保存待测。检测前，取出样品，精细称取混匀后的脑安排0.3 g于0.5 mL离心管，参加900 μL蒸馏水，匀浆机匀浆后取匀浆液150 μL，参加20 μL质量浓度为1 mg·L-1吲哚美辛内标液，涡旋混匀后，参加1 000 μL水饱满正丁醇，涡旋震动5 min，14 000 r·min-1离心10 min，汲取800 μL上清液氮气吹干。残渣参加100 μL复溶液（0.1%甲酸水-甲醇=6∶4），涡旋震动5 min，14 000 r·min-1离心10 min后，取上清进样5 μL剖析。
2.4.3 荧光符号法样品收集 给药后每组别离于5，30，90，180 min处死3只大鼠，取下心、肝、脾、肺、肾及脑安排，一切样品于-70 ℃冷冻保存待测。
2.5 检测办法
2.5.1 色谱条件及质谱条件 ACQUITYTM UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；活动相0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），0.5～1.0 min，90%A；1.0～2.0 min，90%～65%A；2.0～4.8 min，65%～35%A；4.8～5.0 min，35%～10%A；5.0～5.5 min，10%～90%A；5.5～6.0 min，90%A；流速0.3 mL·min-1；柱温35 ℃；进样量5 μL。质谱条件为：α-细辛脑母离子相对分子质量209.0，子离子相对分子质量181.0，锥电压34 V，磕碰能量16 V，保存时刻4.0 min，离子形式ES+；吲哚美辛母离子相对分子质量360.0，子离子相对分子质量140.9，锥电压48 V，磕碰能量20 V，保存时刻4.6 min，离子形式ES+。
2.5.2 荧光符号物的检测办法 取出-70 ℃冷冻保存的大鼠安排样品心、肝、脾、肺、肾及脑，将每只动物的安排样品放入小动物活体荧光成像仪中，对其进行荧光成像，以504 nm作为发射波长，断定示踪纳米粒在大鼠体内不同安排的散布状况。
2.6 数据剖析
2.6.1 血药浓度数据处理 选用药动学核算程序DAS 2.2.1，核算α-细辛脑的药动学参数。试验数据以±s标明。鼻腔给药的肯定生物利费用见下。
2.6.2 脑安排浓度数据处理 选用药动学核算程序DAS 2.2.1，核算α-细辛脑的药动学参数。药物靶向指数[12]（DTI），药物靶向功率[13]（DTE），鼻脑直接传递百分比[14]（DTP）核算公式见下。其间，Bi.n.为药物经鼻腔给药后的AUCbrain，Bx为药物经鼻腔给药后通过血液循环透过血脑屏障进入脑部的AUCbrain，Bi.v.为药物静脉打针后的AUCbrain，Pi.v.为药物静脉打针后的AUCplasma，Pi.n.为药物鼻腔给药后的AUCplasma，试验数据以±s标明。
3 成果
3.1 血药动力学研讨
α-细辛脑在血浆中的含量测定办法学调查成果显现：该液质检测条件下，空白血浆中的内源性物质不搅扰样品峰，α-细辛脑及吲哚美辛的峰别离杰出，相互间无搅扰，办法专特点好。其间，α-细辛脑与内标物吲哚美辛的保存时刻别离为4.0，4.6 min，见图1。线性方程Y=0.029C-0.021 9，r=0.999 3（4.955～991 μg·L-1）。定量限和检测限别离为2.5，0.5 μg·L-1。日内相对标准偏差、日间相对标准偏差、溶液稳定性、回收率及基质效应调查均符合要求。
PLA-α-细辛脑纳米粒经鼻腔、静脉打针给药后，α-细辛脑在大鼠体内的药代动力学曲线见图2。2种给药办法均在第一时刻抵达了最大血药浓度，且鼻腔给药的血药浓度均小于静脉打针。PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药与静脉打针的Cmax别离为（216.2±45.2），（433.2±158.3） μg·L-1。
PLA-α-细辛脑纳米粒静脉打针的AUC0-t與AUC0-∞均大于鼻腔给药，且具有显著性差异。PLA-α-细辛脑纳米粒静脉打针后与鼻腔给药后的MRT0-t无显著性差异。PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后的肯定生物利费用为74.2%，低于α-细辛脑干粉鼻腔给药的肯定生物利费用[15]，见表2。
3.2 脑药动力学研讨
α-细辛脑在脑安排中的含量测定办法学调查成果显现：该液质检测条件下，空白脑安排中的内源性物质不搅扰样品峰，α-细辛脑及吲哚美辛的峰别离杰出，相互间无搅扰，办法专特点好，α-细辛脑与吲哚美辛的保存时刻别离为4.0，4.6 min，见图3。线性方程Y=0.027 6C+0.340 9，r=0.997 4（4.955～991 ng·g-1）。定量限和检测限别离为2.5，0.5 ng·g-1。日内相对标准偏差、日间相对标准偏差、稳定性、回收率及基质效应调查均符合要求。
PLA-α-细辛脑纳米粒经鼻腔给药、静脉打针后α-细辛脑在5，15，30，60，90，180 min在脑安排中的散布见图4，PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后α-细辛脑在脑安排中的浓度大于静脉打针后α-细辛脑在脑安排中的浓度，PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后α-细辛脑在脑安排中的Cmax与静脉打针后的α-细辛脑在脑安排中的Cmax别离为（219.3±48.8），（166.3±21.2） ng·g-1。PLA-α-细辛脑纳米粒静脉打针后α-细辛脑在脑安排中的AUC0-t与AUC0-∞均小于鼻腔给药，但无显著性差异。此外，PLA-α-细辛脑纳米粒静脉打针后与鼻腔给药后α-细辛脑在脑安排中的MRT0-t均无显著性差异，见表3。
PLA-α-细辛脑纳米粒静脉打针与鼻腔给药后药物的脑靶向系数（AUCbrain/AUCplasma）别离为1.16和1.65，PLA-α-细辛脑纳米粒经鼻给药后的药物脑靶向功率（DTE）为142.24%，鼻-脑传递百分率（DTP）为29.83%。
3.3 荧光符号法研讨
香豆素-6是一种脂溶性荧光染料，其检测灵敏度较高，常用于纳米粒递药体系的体表里示蹤和相关机制的研讨[16-18]。依据文献报导，香豆素-6作为荧光探针不会影响载体自身的各项特性，能够较好的反响纳米粒的行为，且香豆素-6走漏程度较低，一般状况下小于5%[19-21]。
PLA-α-细辛脑荧光纳米粒静脉打针后5 min时，其在肝安排中的荧光强度最大，其次为脑安排，而心、脾、肺、肾简直无荧光。30 min时，与5 min比较，肝、脑安排中的荧光强度削弱，心、脾、肺、肾呈现少数荧光，但肝安排中的荧光强度与其他安排比较，仍是最强的，90 min时，心、脾、肺中的荧光面积相对增大，强度仍较弱，180 min时，荧光强度在一切安排中都下降。PLA-α-细辛脑荧光纳米粒鼻腔给药后5 min时，其在脑安排中的荧光强度最大，其次为肝安排。与5 min比较，30 min时脑、肝安排中的荧光强度削弱，心、肺、肾荧光强度添加，但脾中简直无荧光。90 min时，脑安排中的荧光强度与其他安排比较，仍是最强的，与30 min时比较，心和肾中的荧光面积相对减小，180 min时，安排中的荧光强度在4个时刻点中最低，见图5，6。
此外，在5 min和30 min时，PLA-α-细辛脑荧光纳米粒静脉打针后香豆素-6在肝安排中的荧光强度显着强于PLA-α-细辛脑荧光纳米粒鼻腔给药后香豆素-6在肝安排中的荧光强度；而PLA-α-细辛脑荧光纳米粒静脉打针后香豆素-6在脑安排中的荧光强度显着弱于PLA-α-细辛脑荧光纳米粒鼻腔给药后香豆素-6在脑安排中的荧光强度。从某种程度上能够以为：纳米粒静脉打针后具有较强的肝靶向性，而鼻腔给药后脑靶向性更强。
4 评论
本文选用与静脉打针比照的给药办法，研讨了PLA-α-细辛脑纳米粒经鼻给药后α-细辛脑在体内的散布及脑靶向性，成果标明：PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后的脑靶向性强于PLA-α-细辛脑纳米粒静脉打针后的脑靶向性。脑靶向系数别离为1.65，1.16。PLA-α-细辛脑纳米粒鼻腔给药后的肯定生物利费用为74.2%，与文献[22]相共同，标明不同的给药途径能改动药物的脑靶向性。PLA-α-细辛脑纳米粒经鼻腔给药后进入脑安排首要存在2种通路，即一部分药物通过呼吸部黏膜吸收进入血液循环后，透过血脑屏障而进入脑安排，另一部分药物通过嗅黏膜或嗅神经通路直接进入脑安排，后者避开了血脑屏障，这与文献[23-24]报导相共同。张龙开等[25]将β-细辛醚制备成微乳进行鼻腔给药用于医治阿尔茨海默病，成果发现鼻腔给予含药微乳体系后脑靶向性杰出，β-细辛醚微乳鼻腔给药后得到的AUCbrain/AUCplasma均高于静脉打针给药，这与本文的成果也相共同。药物经鼻腔给药后达药峰浓度的时刻较短，能够起到速效的效果[26]。此外，现在还有将α-细辛脑制备成鼻用mPEG-PLA微粒[27]及纳米粒离子灵敏型鼻用原位凝胶[28]的研讨。
本课题组在之前的研讨中选用气流破坏的办法，将α-细辛脑粉末制备成α-细辛脑鼻用干粉吸入剂，通过鼻腔给药的办法能够较好的将药物导入脑部，可是因为该干粉的粒径规模较宽，有部分干粉通过吸入抵达了肺部，且药物浓度与静脉打针抵达肺部的量适当[15]。本文的研讨成果能够发现：PLA-α-细辛脑纳米粒经鼻腔给药后，香豆素-6在肺安排中的荧光强度远远低于静脉打针后的荧光强度，处理了α-细辛脑鼻用干粉吸入剂抵达肺部量较多的缺陷。可是，哪些因素影响PLA-α-细辛脑纳米粒通过不同的通路抵达脑安排还需进一步研讨。
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[责任编辑 曹阳阳]