重组人表皮生长因子凝胶 纤维蛋白溶解体系和转化生长因子—1在子宫全切除术后腹腔粘连发病机制中的效果
赵小迎++金纬纬
[摘要] 意图 檢测安排纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活剂按捺物（PAI-1）和转化生长因子-β（TGF-β）在术后腹腔粘连中的表达，剖析其在子宫全切除术后腹腔粘连发作开展进程中的效果，评论腹腔粘连发作机制。 办法 挑选本院子宫肌瘤患者60例，均行子宫全切除术，开腹手术30例（开腹组），腹腔镜手术30例（腹腔镜A组），搜集同期行腹腔镜下卵巢囊肿剥除术病例30例（腹腔镜B组）。开腹组腹膜翻开后、术中距离30 min、关腹前，腹腔镜组在气腹构成后、术中距离30 min、完毕气腹前别离取外周血5 mL和腹膜；并于术后1 d、2 d、3 d 抽取外周静脉血5 mL，检测血液 t-PA、PAI-1浓度，安排 TGF-β 蛋白和 TGF-β基因表达。 成果 开腹组术中、关腹前血清 t-PA 为（27.79±1.76）ng/L和（24.68±1.73）ng/L，低于腹腔镜A组和B组患者，开腹组术中、关腹前血清 PAI-1为（22.46±1.22）μg/L和（24.31±1.80）μg/L，高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学含义（P<0.05）。开腹组关腹前安排 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因别离为（2.59±0.63）和（34.74±1.92），均高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学含义（P<0.05）；开腹组术后1 d、2 d、3 d 血清 t-PA 低于腹腔镜A组和B组患者，PAI-1 高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学含义（P<0.05）。 定论 开腹组患者 PAI-1、TGF-β 蛋白和基因表达出现较强表达，PAI-1 跟着手术时刻的延伸而添加，t-PA 浓度显着下降，跟着手术时刻的延伸而下降。
[要害词] 腹腔粘连；腹腔镜术；安排纤溶酶原激活物；纤溶酶原激活剂按捺物等；转化生长因子-β
[中图分类号] R713.4+2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）09-0001-04
The role of fibrinolytic system and transforming growth factor-1 in the pathogenesis of peritoneal adhesions after total hysterectomy
ZHAO Xiaoying JIN Weiwei
Department of Obstetrics and Gynecology，Wenzhou Traditional Chinese and Western Medicine Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Objective To investigate the expression of tissue plasminogen activator（t-PA）， plasminogen activator inhibitor（PAI-1）and transforming growth factor-β（TGF-β） in postoperative peritoneal adhesions， and to analyze their role in the development of abdominal adhesions after total hysterectomy，and to explore mechanism of abdominal adhesions. Methods 60 patients with uterine leiomyoma were enrolled in this study. All patients underwent total hysterectomy. There were 30 patients undergoing laparotomy（laparotomy group） and 30 patients undergoing laparoscopic surgery （laparoscopic group A）.30 cases of laparoscopic ovarian cystectomy in the same period were collected （laparoscopic group B）. 5 mL peripheral blood and peritoneum were taken after the opening of peritoneum，intraoperative interval of 30 minutes and before the closing of abdomen in the laparotomy group and after the formation of pneumo-peritoneum， intraoperative interval of 30 minutes and before the end of pneumoperitoneum in the laparoscopic group. The expression levels of blood t-PA， PAI-1 concentration， and TGF-β protein and TGF-β gene in tissue were detected by immunohistochemistry at first day， second day and third day after operation. Results The levels of serum t-PA during surgery and before the closing of abdomen were（27.79±1.76）ng/L and（24.68±1.73）ng/L in laparotomy group， which were lower than those of laparoscopic group A and group B. And the levels of serum PAI-1 during surgery and before the closing of abdomen were（22.46±1.22）μg/L and（24.31±1.80）μg/L ，which were higher than those of laparoscopic group A and group B. And the differences were significant（P<0.05）. The levels of tissue TGF-β protein and TGF-β gene were （2.59±0.63） and （34.74±1.92） in the laparotomy group， which were significantly higher than those in the laparoscopic group A and group B， and the differences were significant（P<0.05）. The serum t-PA level in laparotomy group was lower than that in the laparoscopic group A and group B at first day， second day and third day after operation. And the level of PAI-1 in laparotomy group was higher than that in laparoscopic group A and group B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion PAI-1， TGF-β protein and gene in the laparotomy group were strongly expressed in the laparotomy group. t-PA concentration decreased significantly， and decreased with the operation time.
[Key words] Peritoneal adhesions；Laparoscopy；Tissue plasminogen activator；Plasminogen activator inhibitors；Transforming growth factor-β
腹腔术后出现腹腔粘连是长时刻困绕外科手术的一个难题，腹膜对手术的反响取决于手术伤口的程度，构成机制杂乱[1]。有研讨[2-3]以为血浆纤维蛋白溶解体系的活性关于腹腔粘连的溶解具有重要效果，多种细胞的搬迁和增生及各种生长因子和细胞因子的了腹腔粘连进程，如安排纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）、纤溶酶原激活剂按捺物（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等。安排中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是发动和停止安排修正的一种肽类生长因子[4-5]。本研讨旨在检测t-PA、PAI-1和 TGF-β 在术后腹腔粘连中的表达水平，剖析其在腹腔粘连发作开展进程中的效果，评论腹腔粘连发作机制。现报导如下。
1 材料与办法
1.1 一般材料
挑选本院2014年1月～2015年12月子宫肌瘤患者60例，均行子宫全切除术，开腹手术30例（开腹组），腹腔镜手术30例（腹腔镜A组）搜集在本院因“良性卵巢囊肿”行腹腔镜下卵巢囊肿剥除术的病例30例（腹腔镜B组）。开腹组患者年纪36～62岁，均匀（44.19±8.24）岁，腹腔镜A组患者年纪35～61岁，均匀（44.08±8.31）岁；腹腔镜B组患者年纪37～62岁，均匀（44.29±8.54）岁，各组当选研讨目标年纪比较，差异无统计学含义（P>0.05），具有可比性。
1.2 办法
开腹组腹膜翻开后、术中距离30 min、关腹前别离取腹膜约 0.5 cm×0.5 cm，并抽取外周静脉血 5 mL，腹腔镜A组和B组在气腹构成后、术中距离30 min、完毕气腹前取空腹外周静脉血 5 mL 和腹膜约 0.5 cm×0.5 cm；手术完毕后1 d、2 d、3 d 抽取清晨空腹外周血 5 mL。血液样本-20℃保存备用，安排样本-80℃保存备用。ELISA法测定血液标本 t-PA、PAI-1 浓度。免疫组化法和 real-time PCR 检测安排标本中 TGF-β 蛋白和 TGF-β 基因表达。
免疫组化法首要进程：10% 福尔马林安排固定、白腊包埋、切片，脱蜡、梯度酒精水化；抗原修正，滴加 3% H2O2。滴加非免疫血清阻断非特异反响；滴加 TGF-β 一抗（作业浓度1∶50）；滴加二抗和底物显色液，苏木素复染；二甲苯、封片。兔抗人 TGF-β 多克隆抗体免疫组化试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）。光镜下调查，每张片子取 5个高倍视界，每个视界下计数 100 个瘤细胞，半定量积分法对每张切片细胞进行染色强度分级记分，无上色（0分）、淡黄色（1分）和棕褐色（2分），按阳性细胞面积计0（0分）、1%～25%（1分），26%～50%（2分）、51%～75%（3分）、76%～100%（4分），将两项乘积进行评价其阳性表达强度评价。
RT-qPCR进程：回转录（依托回转录酶将RNA回转录成cDNDA）、扩增（用PCR的办法扩增cDNA）、检测（检测和定量扩增的产品）。对硝酸纖维素膜进行扫描并进行灰度剖析。
1.3 统计学办法
选用 SPSS 19.0 对数据进行统计学处理，计量材料以（x±s）表明，选用t查验，多组间计量材料选用F查验，计数材料比较用χ2查验，P<0.05表明差异有统计学含义。
2 成果
2.1 三组开腹前血清t-PA、PAI-1和安排 TGF-β蛋白、TGF-β基因成果比较
三组术前各项成果比较，差异均无统计学含义（P>0.05）。
2.2 三组术中血清 t-PA、PAI-1和安排 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因成果比较
开腹组术中血清 t-PA 为低于腹腔镜A组和B组患者，开腹组术中血清 PAI-1 高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学含义（P<0.05）。见表2。
2.3 三组关腹前血清t-PA、PAI-1和安排TGF-β蛋白、TGF-β基因成果比较
开腹组关腹前血清t-PA低于腹腔镜A组和B组患者，开腹组关腹前血清PAI-1和安排TGF-β蛋白、TGF-β基因均高于腹腔镜A组和B组患者，差异有统计学含义（P<0.05）。
2.4三组术后不同时刻血清t-PA和PAI-1成果比较
开腹组术后1 d、2 d、3 d血清t-PA低于腹腔镜A组和B组患者，PAI-1高于腹腔镜A组和B组患者，且跟着术后时刻的延伸，血清t-PA和PAI-1水平出现下降和上升趋势，差异具有统计学含义（P<0.05）。见表4。
3 评论
腹腔疾病术后粘连发作率达 90% 以上，是剖腹术后一个严峻难题。腹膜遭到损害时，很多吞噬细胞搬迁并诱导成纤维细胞至创面，激活成纤维细胞发作胶原，并开释多种生长因子与蛋白酶，损坏纤维蛋白溶解与组成平衡，使过度生成的胶原纤维无法被正常溶解与代谢，细胞外基质堆积而导致粘连的构成[6-8]。腹膜对手术的反响取决于手术伤口的程度，最小程度的侵入手术方法可削减术后腹腔粘连的严峻程度。腹腔镜手术具有腹膜损害小，术后粘连发作率低一级长处[9-10]。
多种细胞的搬迁、增生及细胞因子参加了粘连进程，其间纤维蛋白原的开释与溶解的失衡具有要害效果[11]。t-PA 是一种含527个氨基酸的单链糖蛋白，分子量6.8万～7.2万，为丝氨酸蛋白酶，经过裂解纤溶酶原肽键而发挥纤溶效果。PAI 是t-PA的拮抗剂，t-PA和PAI 可反映纤维蛋白堆积和降解之间的平衡，其彼此效果决议了腹膜腔纤溶体系的活性。TGF-β 是多肽链组成的二聚体，TGF-β1是TGF-β宗族中重要的促纤维化因子，是现在已知对纤维化构成和开展等要害细胞因子，可影响间质细胞增殖发作 ECM，诱导体内各种安排纤维化反响[12-14]。
本次研讨成果显现，开腹组术中关腹前血清 t-PA和安排 TGF-β 蛋白、TGF-β 基因表达均高于腹腔镜A组和B组患者，开腹组术中血清 PAI-1 低于腹腔镜A组和B组患者。提示传统开腹手术引起术后腹腔粘连构成的或许性大，过表达的 TGF-β1 诱导成纤维细胞过度增殖与胶原组成。手术损害腹腔，TGF-β1被激活并过量表达，激活 TGF-β1/Smad 信号通路，上调下流 PAI-1 的表达，下调腹膜内 t-PA 表达，增强成纤维细胞活性，按捺腹膜纤溶活性，促进成纤维细胞的过量增殖及毛细血管长入，促进多种胶原蛋白组成并在受损部位堆积，诱发粘连带的构成[15-17]。纤维溶解酶作为体内纤维蛋白降解的重要参加者，其活化首要依托 t-PA，t-PA 能激活纤溶酶原为纤溶酶，将纤维蛋白原和纤维蛋白降解，下降纤维的组成。t-PA 可被体内的 PAI-1所拮抗，受其调理[18-19]。本次研讨成果显现，术后1 d、2 d、3 d，腹膜 t-PA显着下降、PAI-1显着添加，引起术后粘连的或许性也添加。跟着手术时刻延伸，纤维蛋白原的开释和纤维蛋白原的溶解之间的失衡加重，添加术后粘连的或许性。腹腔镜手术对腹膜的损害小，术中气腹使安排创面彼此别离，下降触摸时机，术后腹膜缝线反响轻，均有用下降了腹膜粘连程度[20]。腹腔镜中，气腹的特定状况或许激活了构成粘连的各种机制，气体的挑选、湿度、温度和腹内压或许决议了粘连的构成和血浆纤维蛋白溶解体系的活性，需求进一步进行研讨。
综上所述，开腹组患者PAI-1、TGF-β蛋白和基因表达出现较强表达，PAI-1跟着手术时刻的延伸而添加，浓度显着下降，跟着手术时刻的延伸而下降。腹腔镜术经过下降腹膜在遭到损害TGF-β1和PAI-1的过表达，上调t-PA，完成防治术后腹膜粘连发作和开展。
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（收稿日期：2016-11-21）