低氧大鼠培养箱 大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁反常堆积的调节作用
金微瑛 童夏生 阮正英
[摘要] 意图 探討大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁反常堆积的调理效果。 办法 购买首都医科大学试验动物中心供给的38只健康雄性Wistar大鼠，根据随机数字表法将大鼠分为低氧组（n=14）、低氧+硫氢化钠（NaHS）组（n=12）、对照组（n=12），树立大鼠HPH模型，监测其血流动力学，测定其血浆H2S含量，检测其肺安排中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，最终进行成果断定与半定量剖析、统计学剖析。 成果 低氧组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），血浆H2S含量明显低于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、低氧+NaHS组、对照组大鼠肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白表达逐步下降（P<0.05），低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达均明显高于对照组（P<0.05）。低氧组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、对照组、低氧+NaHS组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原mRNA表达均逐步下降（P<0.05）。 定论 大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢可以有用按捺Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表达，进而或许对低氧性肺血管重塑进行有用缓解，值得临床充沛注重。
[关键词] 大鼠低氧性肺血管重塑；硫化氢；Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白；肺血管壁反常堆积；调理效果
[中图分类号] R543.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0037-04
[Abstract] Objective To investigate the regulatory effects of hydrogen sulfide on abnormal accumulation of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary vascular wall of rats with hypoxic pulmonary vascular remodeling. Methods A total of 38 cases of healthy male Wistar rats purchased from the experimental animal center of Capital Medical University， these rats were divided into hypoxia group （n=14）， hypoxia+sodium hydrosulfide （NaHS） group （n=12） and control group （n=12） according to the random number table method， rat model of HPH was established， hemodynamics was monitored， contents of H2S in plasma were determined， typeⅠand Ⅲ collagen in the lung tissues were detected， finally the results were determined and semi quantitative analyzed and statistically analyzed. Results The mPAP level， RV/（LV+SP） of the hypoxia group were significantly higher（P<0.05）， the content of plasma H2S was significantly lower （P<0.05）， the expression of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary small muscular arteries were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅰ collagen in lung and muscular artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group， control group decreased gradually（P<0.05）， the expressions of type Ⅲ collagen in pulmonary muscular medium artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group were significantly higher than the control group （P<0.05）. The expressions of type Ⅰ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular artery of the hypoxia group were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅲ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular arteries of the hypoxia group， hypoxia group+NaHS group， control group were gradually decreased （P<0.05）. Conclusion Hydrogen sulfide can effectively inhibit the expressions of typeⅠand Ⅲ collagen and mRNA in pulmonary vascular wall， and it may be able to alleviate the pulmonary vascular remodeling of rats， so is worthy of the clinical full attention.
[Key words] Hypoxic pulmonary vascular remodeling of rats； Hydrogen sulfide； Collagen typeⅠand Ⅲ； Abnormal accumulation of pulmonary vascular wall； Regulation
低氧性肺动脉高压（HPH）的病理根底首要为肺血管重塑，而在低氧性肺血管重塑中，胶原重塑占有极为重要的位置，该范畴的重要课题就是研讨其调理机制[1]。以往临床普遍认为[2]硫化氢（H2S）归于毒性废气，最近临床发现[3]，心血管体系会内源性生成H2S，一起其具有重要的病理生理学效应，在调理心肺血管功用的进程中，H2S归于新式气体信号分子，可以在极大程度上缓解低氧诱导的肺血管重塑及肺动脉高压。本研讨探讨了大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁反常堆积的调理效果，现报导如下。
1 材料与办法
1.1 试验动物
2016年1～6月购买首都医科大学试验动物中心供给的38只健康雄性Wistar大鼠（同意号：091017），体重200～1800 g，均匀（190±10）g，根据随机数字表法将大鼠分为低氧组（n=14）、低氧+硫氢化钠（NaHS）组（n=12）、对照组（n=12）。
1.2 办法
1.2.1 大鼠HPH模型 低氧舱有缝隙相通于外界大气，可以为舱内气体以较慢的速度进出供给杰出的前提条件，然后始终坚持舱内气压和大气压的平衡。在进行低氧处理的进程中在低氧舱内放置大鼠，将氮气通入舱内，将舱内的部分氧气替换掉，然后有用下降舱内氧气浓度。用小电扇不断混匀舱内混合气体，选用上海雷磁公司出产的RSS-5100型氧浓度监测仪对舱内氧浓度进行随时监测，对向舱内注入的氮气流量进行操控，途径为对减压阀及气体流量表进行调理，坚持舱内氧浓度为（10.0±0.5）%。在常压低氧舱内放置低氧组、低氧+NaHS组大鼠，舱内O2、N2别离占10%、90%，每天10：00～16：00接连低氧6 h，每天1次，共继续3周。低氧前给予低氧+NaHS组大鼠腹腔打针新鲜装备的14 μmol/kg H2S供体NaHS溶液，每天1次，给予低氧组、对照组大鼠腹腔打针等量生理盐水。三组大鼠具有相同的饮食饮水条件。到达低氧性肺动脉高压大鼠确诊规范，提示造模成功。
1.2.2 血流动力学监测 完结低氧后给予大鼠腹腔打针1.2 g/kg体重乌拉坦麻醉，肺动脉、颈动脉插管别离对肺动脉均匀压（mPAP）、体循环均匀压（mAP）进行测定。将胸腔翻开，取出心脏，别离对右心室（RV）、右心室（LV）+右距离（SP）进行称量，然后核算RV/（LV+SP）。
1.2.3 血浆H2S含量测定 将0.5 mL 1%醋酸锌参加试管中，然后将0.1 mL血浆标本参加其间，混匀后将0.5 mL 30 mmol/L三氯化铁+0.5 mL 20 mmol/L对苯二胺盐酸盐参加其间，在室温下进行20 min的孵育，之后将1 mL 10%三氯醋酸堆积蛋白参加其间，将2.5 mL蒸馏水参加其间将体积补足至5 mL，离心 5 min，将上清液吸出来，在670 nm处对上清液的吸光度（A）值进行检测，然后核算上清液中H2S含量，在此进程中运用亚甲蓝分光光度法，严厉根据规范曲线。
1.2.4 肺安排中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白检测 选用天津TBD公司出产的Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化试剂盒对肺安排中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白进行检测，选用武汉博士德公司出产的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA原位杂交试剂盒对Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA原位杂交进行检测。
1.3 成果断定与半定量剖析办法
阳性信号的规范为光学显微镜下棕黄色颗粒[4]。运用半定量积分办法剖析肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型胶原表达强度，随机检测每张切片中的10条肺小型、中型肌性动脉，外径别离在50 μm以下、50～150 μm之间[5]。
1.4 统计学剖析
选用统计学剖析软件SPSS10.0剖析数据，计量材料用（x±s）标明，多组均数比较用单因素方差剖析（ANOVA），用Bonferroni进一步进行组间比较，查验规范α=0.05。P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 三组大鼠的血流动力学目标比较
低氧组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）之间的差异均不明显（P>0.05），三组大鼠的mAP之间的差异均不明显（P>0.05），见表1。
2.2 三组大鼠的血浆H2S含量比较
低氧组大鼠的血浆H2S含量[（192±22）μmol/L]明显低于低氧+NaHS组、对照组[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠的H2S含量之间的差异不明显（P>0.05）。
2.3 三组大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达比较
低氧组大鼠肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达之间的差异均不明显（P>0.05）；低氧组、低氧+NaHS组、对照组大鼠肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白表达逐步下降（P<0.05），低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达均明显高于对照组（P<0.05），但低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达之间的差异不明显（P>0.05），见表2。
2.4 三组大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达比较
低氧组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达之间的差异均不明显（P>0.05）；低氧组、对照组、低氧+NaHS组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性動脉Ⅲ型胶原mRNA表达均逐步下降（P<0.05），见表3。
3评论
低氧性肺血管重塑一方面包含细胞外基质的改动，另一方面也包含中膜滑润肌细胞的反常增殖。细胞外基质首要包含两种成分，一种为弹性蛋白，一种为胶原蛋白[6-8]。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型等不同类型的胶原存在于血管壁中，其间血管壁的抗张力及耐性受Ⅰ型胶原直接而深入的影响，而其弹性受Ⅲ型胶原直接而深入的影响。在血管壁中，Ⅰ、Ⅲ型胶原占有极为重要的位置，在对血管的完整性保持方面发挥着极为重要的效果[9-13]。相关医学研讨标明[14]，大鼠肺动脉羟脯氨酸（代表胶原）含量特异性在HPH构成的情况下提高，进而一方面在极大程度上提高Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达，另一方面也在极大程度上提高其前胶原mRNA。因而，在低氧性肺血管重塑中，血管壁内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的反常堆积是重要的病理进程。
迄今为止，低氧性肺血管结构重塑的构成机制尚不清楚。气体信号分子如一氧化氮与一氧化碳具有快速发生、敏捷弥散、效果广泛等生物学特性， 它们的发现将肺动脉高压发病机制研讨带入了新的阶段。以往的研讨提示[15-18]，一氧化氮和一氧化碳在低氧性肺血管结构重塑中发挥重要的调理效果。但是低氧性肺血管重塑的构成机制非常复杂，至今尚不明晰。在许多内源性生成的气体分子中，探寻对心肺血管调理具有重要效果的新式气体信号分子并提醒其对肺血管重塑的或许效果机制是该范畴的严重前沿课题。本研讨成果标明，低氧组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组大鼠的血浆H2S含量[（192±22）μmol/L]明显低于低氧+NaHS组、对照组[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05）；低氧组大鼠肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、低氧+NaHS组、对照组大鼠肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白表达逐步下降（P<0.05），低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达均明显高于对照组（P<0.05）；低氧组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达均明显高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、对照组、低氧+NaHS组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原mRNA表达均逐步下降（P<0.05），与上述相关医学研讨成果共同。已有研讨报导[19]，内源性H2S在体内或许有两种存在方式，一种是气体H2S方式，另一种则或许以NaHS方式存在。以NaHS方式存在的H2S简单确保溶液中H2S浓度的安稳， 文献报导H2S的干涉试验多运用NaHS溶液[20]，因而本试验中也选用了NaHS溶液来供给H2S。研讨发现，弥补NaHS后，大鼠血浆中H2S的含量升高，提示低氧时体内减少了的H2S得到了弥补。
总归，大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢可以有用按捺Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表达，进而或许对低氧性肺血管重塑进行有用缓解，值得临床充沛注重。
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（收稿日期：2016-09-11）