纳米涂层 程序化药物开释纳米涂层的构建及其体外试验研讨
杨进 梅劲桦 刘震杰
[摘要] 意图 构建肝素、强的松和紫杉醇程序化药物开释纳米涂层，并调查该纳米涂层的体外开释状况和对血管内皮细胞的影响。 办法 结合异步降解技能和静电纺织技能制备己内酯/碳酸亚乙酯共聚物[Poly（CL-co-EC）]的纳米载体；高压液相色谱法测定载药体系紫杉醇包封率和体外开释曲线；MTT试验和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒别离测定人血管内皮细胞的存活率和LDH开释率。 成果 程序化药物开释体系中肝素、强的松和紫杉醇的包封率别离为97.3%、81.2%和75.7%，载药量别离为10.4%、9.3%和14.1%。三种药物在体外均缓慢开释，60 d时累计开释量别离到达96%、55%和8%。程序化药物开释纳米涂层能明显下降血管内皮细胞的存活率并进步LDH开释率。 定论 程序化药物开释纳米涂层能顺次缓慢开释肝素、强的松和紫杉醇，并按捺血管内皮细胞成长，关于下降支架植入术后血管再狭隘有潜在运用价值。
[关键词] 纳米涂层；紫杉醇；强的松；肝素；血管支架；程序化
[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）36-0005-04
Establishment of nano-coating for controlled drug release and its in vitro experiment
YANG Jin MEI Jinhua LIU Zhenjie
Department of Vascular Surgery， Sir Run Run Shaw Hospital Affiliated to Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310016，China
[Abstract] Objective To establish a nano-coating for controlled heparin/prednisone/taxol release and investigate the release curve of the nano coating and effects on vascular endothelial cells. Methods The technology of asynchronous degradation and electrostatic spinning technique were used to prepare nano-drug carrier. High pressure liquid chromatography（HPLC） was used to determine the embedding ratio and release curve of nano coating. MTT and lactate dehydrogenase（LDH） kits were applied to test cells survival rate and LDH release respectively. Results The embedding ratios of heparin prednisone and paclitaxel in nano-coating were 97.3%，81.2% and 75.7%， and drug-loading rate were 10.4%，9.3% and 14.1%，respectively. These three drugs were slow-release in vitro and the accumulative release quantities were 96%， 55% and 8%. This nano-coating for controlled drug release significantly reduced the survival rate of vascular endothelial cells and improved the LDH release rate. Conclusion The nano coating for controlled drug release established in this study slowly releases heparin， prednisone and taxol step by step， and inhibits the growth of endothelial cells， which supplies a potential way to reduce vascular restenosis after stent implantation.
[Key words] Nano coating； Taxol； Prednisone； Heparin； Stent； Procedural
动脉粥样硬化性冠心病的发作率逐年添加，严重威胁着人类健康[1]。药物洗脱支架作为近年来最为有用的介入医治的一种，是将支架上负载药物定点开释到狭隘部位，保证药物对病灶效果最大化，并将对其他器官的毒副效果降到最小[2]。但是，和其他介入医治相同，药物洗脱支架仍存在术后再狭隘问题[3]，是支架植入术亟待处理的问题。研讨标明[4-6]，支架植入后部分安排呈现以下几个阶段性的改动：①2周内，血小板集合，凝血体系激活，一起炎症细胞集合，重生内皮开端构成；②2～8周内，支架外表逐渐被重生内膜彻底掩盖，滑润肌细胞增殖；③8～32周，细胞外基质排泄增多，成纤维细胞增殖，病灶逐渐纤维化。本文拟将别离具有抗增殖、抗炎和抗血栓才能的紫杉醇、强的松和肝素集中于一个高分子药物开释体系，并构建程序性开释的纳米涂层，旨在分阶段有方针性地按捺血管再狭隘的发作。
静电纺织是归于纳米技能中的一种，其能够制造比用惯例办法小几个数量级的纳米级纤维[7]，易完成药物在部分的长期逗留和靶向开释。咱们前期研讨得出不同单体份额可制备得到不同降解速率的聚己内酯和碳酸亚乙酯共聚物[Poly（EC-CL）]资料，且该共聚物体现出了杰出的生物相容性和理化功能[8]。本研讨即选用[Poly（EC-CL）]共聚物结合异步降解技能和静电纺织技能，别离将紫杉醇、强的松和肝素涂布于一个纳米载体，构建出程序性药物开释纳米涂层，并经过体外试验开端点评其对血管内皮细胞的效果，为往后研发抗内膜增殖程序化药物开释血管内支架的研发供给前期基础研讨。
1 资料与办法
1.1 程序化药物开释纳米涂层的制备
1.1.1 药物载体的制备 共聚物Poly（CL-co-EC）的制备参照已宣布文献[8]，进程归纳如下：①氩气环境下，运用Nd（DBMP）3催化组成不同份额CL/EC含量的共聚物Poly（CL-co-EC）。②样品模压制备成长×宽×高为30 mm×12 mm×2 mm的规整板材。③运用静电纺丝法制备纳米级的纤维、膜资料和支架资料。经过调理电压（0～10 kV）、纺丝液流速（0.1 mL/h～5 mL/h），制备不同纳米直径的纤维。
1.1.2 药物包埋与涂布 紫杉醇的包埋：对CL/EC=9的Poly（CL-co-EC）共聚物混合己二酸酐进行电纺制备孔隙率在90%以上的电纺膜，电纺丝直径在400～800 nm。先期在生理盐水中静置3 d，等酸酐降解后进行扫描电镜调查，并用DMSO溶解紫杉醇，包裹于共聚物颗粒中，颗粒直径在100 nm左右。将先期降解后的Poly（CL-co-EC）电纺膜置于DMSO溶液中24 h，常温。
强的松和肝素的包埋和涂布：外表静电纺CL/EC=6的Poly（CL-co-EC）共聚物电纺丝，以操控紫杉醇的开释。将该薄膜置于必定浓度强的松的溶液中24 h，再进行外表电纺CL/EC=4的Poly（CL-co-EC）共聚物电纺丝，对程序性降解电纺涂层进行外表涂布肝素。
1.2 药物体外开释试验
精确称取程序化开释药物加磷酸盐缓冲溶液（10 mmol/L、pH 7.4）制成均一悬浮液，置于恒温水浴摇床（37℃）中，在130 r/min条件下进行开释试验。每24 h用等体积新鲜缓冲液替换一次开释液，替换出的开释液用HPLC测定紫杉醇、强的松和肝素浓度，HPLC试验条件：反相C18色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，5 m）；活动相为乙腈-水（50∶50，V/V）；流速为1.0 mL/min。紫杉醇、强的松和肝素检测波长别离为227 nm、240 nm、215 nm。别离以紫杉醇、强的松和肝素为外标对照品，选用外标一点法核算各物质含量，制作累积开释曲线。
1.3 体外细胞试验
1.3.1 细胞原代培育 取人体抛弃大隐静脉10～15 cm，PBS溶液洗去残血，0.1%的粗制胶原酶消化3～10 min，得到含内皮细胞的消化液，PBS溶液冲刷后离心去上清，参加RPMI1640培育液制成细胞悬液，在37℃、5%的二氧化碳孵育箱中培育，取对数成长期的细胞进行试验。
1.3.2 细胞存活率试验 MTT试剂盒测定细胞存活率。以104/孔密度接种于96孔细胞培育板，每孔200 μL，每组均设6个复孔。细胞贴壁后换无血清培育基效果24 h，使细胞同步于G0期，别离给予紫杉醇、紫杉醇+强的松和紫杉醇+强的松+肝素的相应血清加以影响，于一起培育24、72 h停止，影响完毕后参加5 mg/mL MTT 20 μL/孔，37℃，5% CO2孵育4 h，当心汲取上清，参加DMSO 150 μL/孔，充沛混匀，在492 nm 波长下测定OD值，然后核算存活率。
1.3.3 乳酸盐脱氢酶开释试验 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测细胞LDH开释量，进程归纳如下：按5000 cell/孔将细胞悬浮液置入96孔板中，先用含5%FBS的RPMI 1640培育基100 μL培育24 h。24 h后96孔板试验孔换成含5%FBS和不同阶段纳米涂层（紫杉醇、紫杉醇+强的松和紫杉醇+强的松+肝素）的24 h或72 h RPMI 1640浸提液100 μL进行培育。加试剂盒工作液并避光30 min后于490 nm下测定OD值。乳酸脱氢酶（LDH）开释率=（处理样品OD-样品对照孔OD）/（最大酶活性OD-样品对照孔OD）×100%。
1.4 统计学办法
选用 SPSS 17.0 统计学软件进行数据单要素方差分析，计量资料以均数±标准差表明，组间两两比较选用LSD法。P<0.05 为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 程序化药物开释纳米涂层的表征
程序化药物开释体系中紫杉醇、强的松和肝素的包封率别离为（75.7±4.2）%、（81.2±5.3）%和（97.3±4.6）%，载药量别离为（14.1±1.9）%、（9.3±1.6）%和（10.4±2.1）%，见表1。
表1 程序化药物开释体系中药物的包封率和载药量（x±s，%）
2.2 程序化药物体外开释试验
从图1能够看出，肝素、强的松和紫杉醇顺次从载体中缓慢开释，在开释试验的第60地利，肝素的累积开释量到达96%，强的松的累积开释量到达55%，紫杉醇的累积开释量仅有8%。
2.3 程序化药物开释纳米涂层在血管内皮细胞的效果
对电纺丝逐渐涂布紫杉醇、强的松和肝素，制备得到程序性开释纳米药物。从表2可知，紫杉醇涂布的纳米药物效果血管内皮细胞24 h，细胞存活率明显下降（P<0.05）；效果72 h后，细胞存活率降到空白组的45.2%（P<0.05），再涂布强的松后，内皮细胞存活率相同明显下降（P<0.05）；肝素涂布后，对内皮细胞也有相似效果。
此外，紫杉醇、紫杉醇+强的松和紫杉醇+强的松+肝素的不同涂布阶段纳米药物效果血管内皮细胞24 h后，细胞LDH开释率较空白组和阴性对照组均明显上升（P<0.05），别离为8.7%（P<0.05）、6.4%（P<0.05）和7.3%（P<0.05）；纳米药物效果72 h后，细胞LDH开释率别离到达15.6%、13.5%和13.9%，均明显高于空白组和阴性对照组水平（P<0.05）。
表2 程序化纳米药物对血管内皮细胞的影响（x±s，%）
注：阴性对照为空载纳米资料处理组；*表明与空白组比较，P<0.05； #表明与阴性对照组比较，P<0.05；LDH：乳酸脱氢酶
3 评论
因为人口老龄化和饮食食谱的改动，动脉粥样硬化性导致的缺血性疾病发病率逐年升高。现在针对部分动脉狭隘的首要医治手法是动脉旁路手术和经皮动脉腔内介入医治。其间介入医治伤口小、康复快、患者易于承受，是现在各大医疗中心常用的医治手法。上世纪70年代呈现的经皮腔内冠状动脉成形术，是运用球囊直接扩张狭隘的动脉，改进血流供给，但术后管腔弹性回缩，部分滑润肌及细胞外基质增生会导致管腔再狭隘[9]，二次手术率高达30%～50%。80年代呈现的血管内支架植入术，处理了管腔弹性回缩构成的术后管腔丢掉，下降了再狭隘率，但仍存在管腔和管壁重构导致的支架内再狭隘，其6个月内再狭隘率约为20%左右[10]。近年来呈现的药物洗脱支架，在支架支撑血管的一起，涂层中的药物能挑选性地按捺内膜和滑润肌细胞过度增殖和搬迁，更为有用地避免了血管再狭隘[11]。但是药物洗脱支架植入后仍有5%～10%的再狭隘率。现在研讨以为，支架内再狭隘可能与凝血体系激活、部分炎症反响、血管再内皮化受阻、部分细胞外基质堆积以及滑润肌细胞的搬迁与增殖有关，且是一个多要素相互影响的杂乱进程[12]。另一方面，支架植入后跟着时刻的不同，支架部分安排的病理生理进程呈现出阶段性的改动。因而独自一种药物涂布的支架仅仅在某一阶段的某一方面改进血管再狭隘，这可能是现有药物洗脱支架植入后血管再狭隘的重要原因之一。
医用血管支架最常用的两种资料是可降解合金和可降解高分子资料[13，14]，前者具有杰出的支撑功能，而高分子资料愈加多样的结构特性和可控的降解速率得到更多重视。本研讨选用了新式高分子资料聚己内酯和碳酸亚乙酯共聚物Poly（CL-co-EC）来构建药物涂层，经前期研讨发现该资料在降解的一起能坚持其整体性和支撑力，一起体现出了杰出的生物相容性和理化功能[8]，而酸酐混纺使得该资料涂层进步了空地率，增大了载药量和常温加药。不同份额CL和EC的共聚物具有不同的降解时刻，本研讨逐渐将紫杉醇、强的松和肝素别离涂布于CL/EC=9、CL/EC=6和CL/EC=4的Poly（CL-co-EC）纳米载体中，构建出程序性开释纳米药物。
HPLC检测程序性纳米药物体外开释状况，成果与预期一起：肝素、强的松和紫杉醇别离先后缓慢开释，在试验完毕时（第60天），肝素累计开释量到达96%，强的松达55%，紫杉醇最终开释，累计开释量达8%。肝素是一种抗凝剂[15]，其最早开释能起到按捺血小板集合的效果，然后下降或推延重生内皮的构成。强的松能够经过按捺结缔安排增生、下降毛细血管壁和细胞膜的通透性以按捺炎性反响[16]，本研讨中强的松从第10天开端缓慢开释，以期能改进植入支架周围血管壁的炎性状况。肝素和强的松的一起开释均能按捺重生内膜的构成。紫杉醇能使细胞逗留在G2/M期进而导致其逝世，是临床上被广泛运用的一种抗增殖药[17]。本研讨中紫杉醇从第25天开端有少数开释，试验晚期时累积开释量达10%。因为CL/EC=9的Poly（CL-co-EC）共聚物降解周期远超出60 d，估计紫杉醇在60 d之后的开释量将继续添加，这个进程能够按捺血管成纤维细胞的增殖。
本研讨中构建的这种程序化开释药物以期在支架植入后不同阶段对立支架部分安排的病理状况，第一阶段：肝素和强的松进行先期开释，起抗凝和按捺部分炎症的效果；第二阶段：强的松和紫杉醇的开释，按捺滑润肌细胞的搬迁、增殖，按捺内膜过度增生；第三阶段：紫杉醇开释，按捺成纤维细胞增生和胶原组成。体外试验证明该研讨中构建的程序化开释纳米涂层具有按捺血管内皮细胞成长的效果。而程序化药物开释纳米涂层支架在血管内的效果还有待进一步的动物试验来验证。
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（收稿日期：2014-08-14）