心肌缺血的前期症状 间歇性低氧在大鼠心肌缺血/再灌注损害中的维护机制
王媛媛 曹建 万建华
[摘要]意图 研讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、低氧誘导因子（HIF-1α）、血管内皮生长因子2（VEGF-2）在间歇性低氧对大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）损害中的表达及维护机制。办法 选取72只大鼠随机分为假手术组（n=18）、I/R+间歇性低氧（I/R+IH）组（n=18）、I/R组（n=18）、I/R+IH+磷脂酰肌醇3-激酶按捺剂组（I/R+IH+PI3K按捺剂组）（n=18），将大鼠露出于低氧循环制造空隙性低氧动物模型，选用球囊结扎冠脉办法制造心肌缺血/再灌注动物模型。经过试剂盒检测心肌安排丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，经过超声心动图监测大鼠舒张晚期容积、缩短晚期容积、左心室射血分数，经过Western blot法检测蛋白激酶B（AKt）、HIF-1α、VEGF-2表达。成果 与假手术组比较，I/R组的MDA、CK-MB高于假手术组，GSH低于假手术组，左心室舒张晚期容积及缩短期晚期容积高于假手术组，左心室射血分数低于假手术组，AKt蛋白及HIF-1α、VEGF-2表达低于假手术组，差异有统计学含义（P<0.05）。I/R+IH组反映氧化损害的MDA、CK-MB低于I/R组，GSH高于I/R组；左心室舒张晚期容积及缩短期晚期容积低于I/R组，左心室射血分数高于I/R组，AKt蛋白及HIF-1α、VEGF-2表达高于I/R组，差异有统计学含义（P<0.05）。I/R+IH+PI3K按捺剂组的MDA、CK-MB高于I/R+IH组，GSH低于I/R+IH组；左心室舒张晚期容积及缩短期晚期容积高于I/R+IH组，左心室射血分数低于I/R+IH组，AKt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达低于I/R+IH组，差异均有统计学含义（P<0.05）。定论 IH在心肌缺血损害中具有心脏维护效果，其维护机制与激活磷脂酰肌醇酯3-激酶信号通路及促进HIF-1α、VEGF-2表达有关。
[关键词]间歇性低氧；磷脂酰肌醇3-激酶；心肌缺血/再灌注；低氧诱导因子α；血管表皮生长因子2
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）1（a）-0004-04
[Abstract]Objective To study the expression of phosphatidylinositide 3-kinase signaling pathway （PI3K），hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α），vascular endothelial growth Factor-2 （VEGF-2） and to studied the correlation protection mechanism of intermittent hypoxia on heart ischemia/reperfusion （I/R） injury in rats.Methods 72 rats were randomly divided into the sham-operated group （n=18），the myocardial I/R group （n=18），the myocardial I/R+intermittent hypoxia （IH） group （I/R+IH） （n=18） and the myocardial I/R+IH+phosphatidylinositide 3-kinase （PI3K） inhibitor （wortmannin ） group （IH+I/R+PI3K inhibitor group） （n=18）.Mice were exposed to cycles to establish the IH model.I/R model was established by ligating the left anterior descending coronary artery.The MDA and GSH of cardic muscle tissues，and the serum biomarkers CK-MB in the four groups were detected.The LV end-diastolic volume （LVEDV），LV end-systolic （LVESV），LV ejection fraction （LVEF） of the rats by echocardiography after 8 weeks were assessed.The expression of phosphorylation of protein kinase B （Akt），HIF-1α，VEGF-2 was analyzed by Westen -blot.Results The level of MDA，CK-MB，LVEDV，LVESV of the I/R group was higher than that of the sham-operated group，the value of GSH，LVEF and the expression of AKt，HIF-1α，VEGF-2 of the I/R group was lower than that of the sham-operated group，with significant difference （P<0.05）.The level of MDA，CK-MB，LVEDV，LVESV of the I/R+IH group was lower than that of the I/R group，the value of GSH，LVEF and the expression of AKt，HIF-1α，VEGF-2 of the I/R+IH group was higher than that of the I/R group，with significant difference （P<0.05）.The level of MDA，CK-MB，LVEDV，LVESV of the I/R+IH+PI3K inhibitor group was higher than that of the sham-operated group，the value of GSH，LVEF and the expression of AKt，HIF-1α，VEGF-2 of the I/R+IH+PI3K inhibitor group was lower than that of the sham-operated group，with significant difference （P<0.05）.Conclusion The PI3K/Akt pathway and the expression of HIF-1α，VEGF-2 is important for IH-induced cardioprotection and may represent aviable target to reduce myocardial I/R injury.endprint
[Key words]Intermittent hypoxia；Phosphatidylinositide 3-Kinase；Myocardial ischemia reperfusion；Hypoxia-inducible factor 1α；Vascular endothelial growth factor-2
间歇性低氧是指给机体以重复的中等强度的低氧影响，增强机体对此种甚至更高程度低氧的耐受力，以防止对机体真实不可逆损害的发生[1]。有研讨显现，低氧习惯能够添加心脏对缺氧缺血损害的维护效果[2]。PI3K及下流靶蛋白所组成的信号途径是现在细胞内重要的信号转导通路之一，具有调理细胞增殖分解凋亡的效果。本试验旨在评论在间歇性低氧条件下，PI3K、HIF-1α、VEGF2在心肌缺血/再灌注损害中的表达及维护机制。
1目标与办法
1.1试验动物
本试验经南昌大学医学院动物道德委员会查看经过，许可证号为SCXK（赣）2009-0001。取10周左右雄性SD大鼠72只，体重（180±18）g，由南昌大学动物试验中心供给。
1.2首要仪器与试剂
渥曼青霉素购自Alexis公司，谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）监测试剂盒（武汉亚法生物制品有限公司），小鼠抗Akt单克隆抗体、HIF-1α抗体、VEGF-2抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗小鼠辣根过氧化物酶符号的二抗购自美国Sigma公司，蛋白浓度测定规范品购自普利莱公司。
1.3试验分组及处理
将试验动物分为4组，制造大鼠制造间歇性低氧模型[3]，详细如下。每日在低氧氧舱别离承受4次减压低氧处理，每次低氧循环承受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再氧和处理5次，间歇性低氧处理14 d。未进行低氧处理的大鼠作为对照组。制造大鼠缺血/再灌注模型，10%水合氯醛麻醉大鼠，按文献办法制造制造模型医治[4]。假手术组（n=18）：丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，经过尾静脉打针生理盐水；I/R组（n=18）：制造大鼠缺血/再灌注模型；IH+I/R组（n=18）：树立间歇性低氧动物模型后，制造缺血/再灌注模型；IH+I/R+PI3K按捺剂组（渥曼青霉素）（n=18）：树立间歇性低氧模型，制造缺血/再灌注模型时，冠状动脉左前降支阻塞15 min前打针磷脂酰肌醇酯3激酶按捺剂-渥曼青霉素（腹腔打针）。
1.4调查目标及检测办法
1.4.1 MDA、GSH、CK-MB含量监测 缺血/再灌注2 h后自腹主动脉取血5 ml，静置30 min，离心10 min（4℃，3000 r/min），血清别离，按试剂盒阐明测定MDA、GSH、CK-MB含量。
1.4.2大鼠左心室缩短期晚期容积、舒张晚期容积、射血分数测定 试验大鼠在外科处理8周后走超声心动图查看。选用异氟烷轻度全身麻醉，选取12 MHz探头，二维心室图从胸骨旁长轴短轴和四个腔室定位取得，经过Modified Simpson Rule丈量左心室缩短晚期容积（LVESV）及舒张晚期容积（LVEDV），核算左心室射血分数，同一调查者选用双盲法丈量一切丈量值，一切丈量成果接连测5次取平均值。
1.4.3 Western blot法检测 Akt、HIF-1α、VEGF2蛋白表达 制模完毕后处死手术处理后的存活大鼠，提取碾磨心肌安排，按蛋白提取试剂盒阐明书进程提取总蛋白，BCA法蛋白进行蛋白定量，搜集上清液，SDS-PAGE别离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，常温下TBST关闭过夜，再参加一抗，沉积，洗膜，显色。详细办法参照文献，试验胶片扫描后用Image J软件进行图画剖析，比值成果表明蛋白的相對含量，用Gel-ProAnalyzer剖析软件剖析通道蛋白的灰度值。
1.5统计学剖析
选用SPSS 15.0统计学软件对数据进行处理，计量材料以均值±规范差（x±s）表明，组间两两比较选用q查验，多组间比较选用方差剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1各试验组MDA、GSH、CK-MB水平的比较
与假手术组比较，I/R组反映氧化损害的MDA、CK-MB含量高于假手术组，GSH含量低于假手术组，差异均有统计学含义（P<0.05）；与I/R组比较，IH+I/R组的CK-MB、MDA含量低于I/R组，GSH含量高于I/R组，差异均有统计学含义（P<0.05）；与IH+I/R组比较，IH+I/R+PI3K按捺剂组的CK-MB、MDA含量高于IH+I/R组，GSH含量低于IH+I/R组，差异均有统计学含义（P<0.05）（表1）。
2.2各试验组大鼠左室容积、射血分数的比较
各试验组外科处理后，8周后经过超声心动图测LVEDV、LVESV、LVEF。I/R组的LVEDV、LVESV、LVEF与假手术组比较，差异有统计学含义（P<0.05）；IH+I/R组的LVEDV、LVESV、LVEF与I/R组比较，差异有统计学含义（P<0.05），提示间歇性低氧对缺血/再灌注损害的大鼠心功用有维护效果；IH+I/R+PI3K按捺剂组的LVEDV、LVESV、LVEF与IH+I/R组比较，差异有统计学含义（P<0.05），运用PI3K按捺剂组后，间歇性低氧对缺血/再灌注损害大鼠心功用维护效果下降（表2）。
2.3各试验组心肌安排Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达
经过Western blot法检测各试验组的Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白水平，成果显现，I/R组的Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达低于假手术组，差异有统计学含义（P<0.05）；IH+I/R组的Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达高于I/R组，差异有统计学含义（P<0.05），提示间歇性低氧促进了Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达添加；IH+I/R+PI3K按捺剂组的Akt、HIF-1α、VEGF2蛋白表达低于IH+I/R组，差异有统计学含义（P<0.05），提示在间歇性低氧状况下，PI3K按捺剂组不仅对Akt表达有关，并且HIF-1α、VEGF-2表达与PI3K信号通路激活有显着联系（表3、图1）。endprint
3评论
间歇性低氧习惯可减轻应激、缺血/再灌注及心律失常等心肌损害，长时间习惯高原低氧能添加心脏对缺血损害的习惯能力[5-6]。可是现在关于间歇性低氧详细心肌维护效果机制的研讨仍是十分匮乏。
磷脂酰肌醇-3激酶是细胞内信号传导有关的脂类第二信使，可经过信号转导、改进心肌缩短力及直接调理钙通道钙离子内流等方面调理心肌功用[7-8]，在缺血/再灌注损害中有重要效果。
本试验树立间歇性低氧模型，发现间歇性低氧预处理后，Akt蛋白表达高于I/R组，MDA、CK-MB含量低于I/R组，GSH含量高于I/R组，左心功用改进；而运用PI3K按捺剂组后，Akt蛋白表达低于IH+I/R组，MDA、CK-MB含量高于IH+I/R组，GSH含量低于IH+I/R组，LVEF低于IH+I/R组。试验成果提示间歇性低氧能够激活PI3K-Akt信号途径，添加AKt蛋白表达，削减细胞氧化损害及减轻心肌缺血/再灌注损害。
试验一起检测了低氧诱导因子HIF-1α及其下流因子VEGF-2在间歇性低氧处理后的表达，HIF-1α坐落细胞质中，但在低氧条件下，HIF-1α稳定性和转录活性可明显添加，在缺血安排中介导促血管生成的效果[9-11]。血管内皮生长因子促进内皮细胞分裂、增殖、搬迁、趋化，构成新血管。血管内皮生长因子VEGF-2在安排缺氧时能影响血管重生[12-14]，并且还具有按捺凋亡蛋白表达上调，促进血管重生，保持内皮细胞存活的功用[15-17]。
本试验成果显现，间歇性低氧处理后，PI3K-Akt信号通路激活，心肌缺血/再灌注损害减轻，HIF-1α表达添加，下流因子VEGF-2添加，间歇性低氧心肌维护效果与间歇性低氧状况AKt活化削减细胞氧化损害削减细胞凋亡有关，一起也与低氧诱导因子及血管内皮生长因子促进重生血管有关，而运用PI3K按捺剂后，AKT表达下降的一起，HIF-1α及下流因子VEGF-2表达也一起下降，提示低氧诱导因子及血管内皮生长因子的表达中需求激活PI3K-Akt信号途径，需求AKt蛋白高表达，一起提示PI3K/AKT通路除了减轻氧化损害调理细胞增殖凋亡外，还在重生血管的构成中发挥着重要效果。除此之外，PI3K/AKT信号通路还或许经过按捺促凋亡蛋白、调理钙离子在心肌细胞胞质中的浓度，促进心肌细胞能量的代谢以及按捺炎症反响的进行等进程完结多种机制发挥心肌维护效果[18-20]，其内涵机制值得进一步研讨评论。
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（收稿日期：2017-09-20 本文編辑：祁海文）endprint