小鼠胚胎干细胞 环孢霉素A对小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分解的影响及调控机制
颜培实+段丽钦+毕莎莎+王晓旭
[摘要]意图 讨论环孢霉素A（CSA）对小鼠胚胎干细胞（ESCs）向心肌细胞分解的影响及调控机制。办法 运用分阶段胚胎干细胞向心肌细胞的分解体系，设ESCs自发组和CSA诱导组，用细胞免疫安排化学和流式细胞仪（FACS）评价心肌细胞分解率以及计数。细胞免疫化学检测CSA诱导出的心肌细胞标志物的表达。在ES细胞分解的不同阶段增加CSA，调查CSA是否特异地效果于某一特定的分解阶段。别离增加别的一种免疫按捺剂也是钙调磷酸酶按捺剂他克莫司（FK506）和T细胞核因子（NFAT）按捺剂11R-VIVIT，与增加CSA比较，比较各组的心肌细胞分解率。成果 ESCs自发组的心肌细胞分解率为（6.00±0.05）%，CSA诱导组为（60.00±0.08）%，兩组比较，差异有统计学含义（P<0.05），且诱导生成的心肌细胞具有心肌细胞特有的特征。CSA特异性地效果于中胚层干细胞，促进其分解成心肌干细胞；CSA强力促进中胚层干细胞分解成心肌细胞增多，相反分解成的上皮细胞削减；增加FK506和11R-VIVIT后没有呈现相似CSA的促心肌分解效果。定论 CSA特异地效果于中胚层干细胞，经过非NFAT径路，可以强力诱导ESCs向心肌细胞分解。
[关键词]环孢霉素A；心肌干细胞；胚胎干细胞；心肌细胞；分解
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）09（a）-0004-04
Influence of Cyclosporine A on the differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes and its regulatory mechanism
YAN Pei-shi DUAN Li-qin BI Sha-sha WANG Xiao-xu
The First Department of Cardiology，Dalian Central Hospital in Liaoning Province，Dalian 116033，China
[Abstract]Objective To explore the influence of Cyclosporine-A （CSA） on the differentiation of mouse embryonic stem cells （ESCs） into cardiomyocytes and its mechanism of regulation.Methods The differentiation system of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes by stages was used，and ESCs spontaneous group and CSA induction group were designed.The differentiation rate and count of cardiomyocytes were evaluated by cell immunohistochemistry and flow cytometry （FACS）.The expression of CSA-induced cardiomyocyte markers was detected by cell immunohistochemistry.CSA was added at different stages of ES cell differentiation to observe whether CSA specifically acted on a particular differentiation phase.Another immunosuppressive agent including tacrolimus （calcineurin inhibitor：FK506） or 11R-VIVIT （nuclear factor of activated T cells：NFAT） was separately added in order to compare the differentiation rate of cardiomyocytes among the groups.Results In the ESCs spontaneous group，the differentiation rate of cardiomyocytes was （6.00±0.05）%，and the rate in the CSA-induction group was （60.00±0.08）%，which was displayed a statistical difference （P<0.05）.The cardiomyocytes generated from induction possessed the unique characteristics.CSA specifically acted on mesodermal stem cells and promoted the differentiation of these cells into cardiac stem cells.The amount of myocardial cells was increased differentiated from mesodermal stem cells strongly promoted by CSA，while the number into epithelial cells was in decrease.After adding FK506 and 11R-VIVIT，there was no similar effect of CSA on promotion of cardiomyocyte differentiation.Conclusion Cyclosporine-A specifically acts on mesodermal stem cells and can powerfully induce these ESCs into the differentiated cardiomyocytes via non-NFAT pathway.endprint
[Key words]Cyclosporine A；Cardiac stem cells；Embryonic stem cells；Cardiomyocytes；Differentiation
近年胚胎干细胞研讨已证明胚胎干细胞可以诱导分解成心肌细胞，移植到体内后可构成心肌安排，这无疑给心肌再生医疗带来了新的期望和挑选[1-2]。可是移植心肌细胞的办法一向未彻底树立，首要由于现在十分有用和特异地诱导胚胎干细胞向心肌细胞分解扩增办法有限，搜集很多移植用的心肌细胞较困难[3]。
有研讨报导了一个不同于传统拟胚体的ESCs体外分解体系[4-5]，是一个二维细胞培育体系。内皮细胞（血管上皮细胞）、血细胞和血管平滑肌细胞和心肌细胞可以别离体系地从一起的中胚层干细胞诱导出来，即表达Flk1（也是血管内皮成长因子受体2）的细胞。运用这一分解体系还成功断定了Flk1+中胚层干细胞衍生的心肌干细胞群，即FCV细胞群（Flk1+/CXCR4+/血管上皮cadherin-）。
当进行细胞移植研讨时，为调查环孢霉素A（Cyclosporine-A，CSA）是否对供体细胞的分解和成长有影响，本研讨运用二维ESCs培育体系在体外检测CSA对ESCs向心肌细胞分解的影响。
1试剂与办法
1.1 首要试剂
诺华公司赠送环孢霉素A（CSA），用二甲基亚砜溶解为30 mg/ml，用时运用培育液稀释成1～3 μg/ml。Astellas 公司赠送FK506，用二甲基亚砜溶解为10 mg/ml，用时运用培育液稀释成（10 ng～1 μg）/ml。11R-VIVIT从Calbiochem购买。小鼠E-cadhein Flk1单克隆抗体由日本京都大学赠送。小鼠CD31 和 biotinylated-CXCR4单克隆抗体从BD Pharmingen购买。多克隆兔GFP抗体从MBL购买。小鼠抗心肌肌末节抗体（α-actinin）从Sigma公司购买，单克隆抗肌钙蛋白T（cTnT）抗体从NeoMarkers公司购买。
1.2办法
1.2.1鼠ESCs培育及分解 本研讨运用EMG7胚胎干细胞株，因导入了αMHC启动子操控的GFP基因，所以当分解的心肌细胞呈现自主搏动时，可在荧光显微镜下调查到心肌细胞的绿色荧光。胚体干细胞的培育办法同前[4]。单纯加培育液的设为对照组（n=5）；培育液参加CSA（n=5），即CSA组，在Flk1阳性细胞接种到OP9细胞上时参加CSA。
1.2.2 OP-9细胞的预备 培育办法同前[4]。
1.2.3流式细胞仪剖析细胞分解率和别离提纯细胞后计数 经过96～108 h的培育，消化搜集细胞，参加APC-Flk1抗体后，用DAPI符号，用流式细胞仪剖析Flk1分解率并将Flk1阳性细胞别离出来，持续在OP9细胞上培育2 d，把细胞从培育皿上消化，搜集起来，与PE-AVAS12和biotinylated-CXCR4抗体相继结合，再与streptavidin-APC结合，用FACS-Vantage剖析FCV阳性率并别离提纯FCV阳性细胞；在OP9细胞上培育6 d，将搜集的细胞与抗CD45或CD31抗体结合，用FACS剖析血细胞或内皮细胞和GFP阳性的心肌细胞。
1.2.4细胞免疫荧光检测 吸掉培育液，4%多聚甲醛室温固定15 min，冷PBS洗刷2次，加1%BSA室温下关闭30 min。cTnT抗体（1∶2000稀释），α-actinin（1∶200稀释）4℃孵育过夜。来日，PBS洗刷2次，Alexa546符号的兔抗鼠抗体（1∶200稀释）室温孵育1 h；PBS洗刷后符号0.1 μg/ml DAPI，最终在荧光显微镜下观测。
1.2.5定量剖析心肌细胞的分解率 cTnT的荧光强度运用电子CCD相机勘探，数据用Image-Pro Plus图画处理软件处理。
1.3统计学处理
选用SPSS 17.0软件对所需数据进行统计学剖析，计量材料用x±s表明，组间比较选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 CSA可以促进ESCs向心肌细胞分解
参加CSA后GFP阳性的心肌细胞明显增加。心肌细胞分解率：ESCs自发组为6%，CSA诱导组为60%，两组差异有统计学含义（P<0.05）（图1）。
2.2 CSA效果生成的心肌细胞正常表达标志物
肌钙蛋白T（图2A）和心肌肌末节α-actinin（图2B、C）。
2.3 CSA效果在哪一个分解阶段
CSA对未分解的ES细胞向Flk1+細胞分解进程无任何影响（图3A）。与ESCs自发组比较，CSA效果于Flk1+细胞后，特异地增加FCV细胞10～20倍（图3B），FCV最高分解率达40%，经过FACS计数，发作的FCV细胞数可增加约22倍[ESCs自发组：（0.2±0.001）×103cells/104 Flk1 cells，CSA诱导组：（4.3±0.23）×103cells/104 Flk1 cells，n=12，P<0.01]（图3C）。CSA效果于纯化的FCV细胞后，只细微地增加心肌细胞的生成，与ESCs自发组比较，约2.6倍（图3D），成果表明CSA诱导心肌的这一新活性，约束在中胚层构成后的分解阶段，首要效果于中胚层和心肌干细胞之间的阶段，可有用、特异地诱导扩增心肌干细胞生成。
2.4 CSA这一活性的细胞和分子机制
在FLk-第0～6天增加CSA，强力促进心肌细胞生成，相反上皮细胞或血细胞生成削减（图4A）。CSA和FK506都是钙调磷酸酶按捺剂，经过按捺NFAT起到免疫按捺效果。可是，FK506和一种NFAT按捺剂11R-VIVIT，用咱们的分解体系对心肌分解无影响（图4B），说明CSA的促进心肌分解活性应该是不依靠NFAT途径的，说明CSA强力促进心肌分解的活性应该是经过新的机制被激活，它是特异地效果于中胚层细胞，经过NFAT非依靠途径，可特异、有用地扩增心肌干细胞。针对CSA这一活性的切当机制研讨将供给心肌分解和再生的新分子机制。endprint
3討论
心血管疾病中心肌梗死严重危害人类健康。发作心肌梗死的心肌安排不能再生，存活心肌安排代偿才能满意不了机体需求时，逐步导致心脏泵功用衰竭，各种保存医治不可能从根本上解决问题，心脏移植受方方面面约束，困扰了临床医治。研讨者们必定寻觅新的、更有用的医治办法。跟着细胞和安排工程研讨的不断开展，干细胞移植技能在医治心血管疾病中备受瞩目[6-8]。但是，细胞医治运用于心肌梗死的医治，切当的效果机制没有彻底说明，临床运用的有用性和安全性仍然是现在研讨者们重视和争辩的焦点[9-10]。
研讨者们一向企图找到一种体外诱导胚胎干细胞分解为心肌细胞的办法，抱负的办法无疑是消耗少，功率和纯度高、产量大，才契合临床运用的要求。本研讨运用发现的CSA效果于中胚层的新功用，提出了一种特异有用地从ESCs扩增心肌细胞的办法。免疫按捺剂CSA是一种钙调磷酸酶拮抗剂，可以阻断T细胞内的NFAT的信息通路，然后发挥免疫按捺剂的效果[11]。多项研讨还发现CSA参加了许多其他的细胞活动，比方心脏瓣膜的构成[12]，心肌肥厚[13]和毛发的成长[14]。国外学者发现CSA效果于拟胚体有弱小地促心肌分解效果[15]，能否促心肌细胞分解及进一步的分子机制不清楚。这种不同于拟胚体的分阶段胚胎干细胞分解体系应该可以明确地挖掘出CSA的强力效果于中胚层和新的非NFAT依靠的活性，而这一活性被拟胚体中细胞混合物所掩盖。这种培育体系将有利于运用生化技能挑选小分子化合物，然后发现新的促心肌再生药物。
相对CSA强力促进心肌细胞分解的效果，另一种钙调磷酸酶按捺剂——FK506却没有显现出促心肌分解的活性。FK506经过与FKBP12结合而发挥各种活性，与CSA在结构，结合蛋白和药代学等方面有些不同。未来环绕CSA这一活性的机制研讨将有助于揭开心肌分解和再生的分子机制。
CSA具有悠长的临床运用前史，它的安全性现已得到证明[16]。信任不久的将来，运用CSA扩增心肌细胞的办法将会被运用于临床，被广泛用于心肌再生的医治。
近几年，诱导多功用干细胞（iPS）经过转入特定的转录因子，成功地从人体细胞发作[17-20]。这种CSA介导的心肌分解办法将扩展运用到iPS分解中，将会广泛益于心肌再生的开展。
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（收稿日期：2017-02-08 本文編辑：许俊琴）endprint