肝癌细胞肿瘤的药物 桦木酸对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响

陈飞宇 李澎 甘加宽 张安娜 任钧国 刘建勋

摘要：意图 调查桦木酸（betulinic acid，BA）对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞成长周期和细胞凋亡两方面开始评论其抗肝癌的效果机制。办法 体外培育人肝癌HepG2肿瘤干细胞并证明其自我更新才能。CCK-8法检测40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L BA效果人肝癌HepG2肿瘤干细胞24、48 h的细胞生机；40、20、10、5 μmol/L BA效果人肝癌HepG2肿瘤干细胞48 h，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。成果 BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖有显着的按捺效果，并呈必定的量-效联络；BA能显着影响肿瘤干细胞周期，诱导肿瘤干细胞凋亡，40 μmol/L BA显着阻滞细胞周期于S期，且细胞凋亡率到达10.86%。定论 BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖具有显着的按捺效果，其或许经过影响肿瘤干细胞周期及诱导肿瘤干细胞凋亡而发挥效果。

关键词：桦木酸；石见穿；人肝癌HepG2细胞；肿瘤干细胞；细胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0060-05

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显现，肝癌在60岁以下的男性中属发病率最高和死亡率最高的癌症[1]。因为肝癌的高复发、高搬运率和化疗抗药性，医治效果并不达观。近年来，越来越多的学者以为完全治好肿瘤的有用疗

法除针对肿瘤安排中的大部分肿瘤细胞，更重要的是靶向其间的肿瘤干细胞[2-3]。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤安排中存在的极小部分细胞，一般处于停止状况，当遭到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发作、搬运和复发，这均源于CSC具有很强的自我更新及增殖分解的才能。咱们前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内挑选，发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤效果[4-5]，进一步对石见穿进行化学成分剖析，发现桦木酸（betulinic acid，BA）为石见穿发挥抗肿瘤效果的首要有用成分之一。因而，本试验调查BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞成长周期和细胞凋亡两方面开始评论其抗肝癌的效果机制。

1 试验材料

1.1 细胞株

人肝癌HepG2细胞株，我国科学院细胞库，目录号TCHu72。

1.2 首要试剂与仪器

BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普药业），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培養基（Gibco），肝素（Sigma），B27神经细胞成长增加剂（Gibco），碱性成纤维细胞成长因子（bFGF，Acro Biosystem），成纤维细胞成长因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青链霉素混合液（Solarbio），磷酸盐缓冲液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），无酚红DMEM（Macgene），CCK-8试剂盒（Dojindo），细胞周期试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（BD）。MCO175型CO2培育箱（德国Galaxy公司），TH-200型显微镜（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶标仪（美国Biotek公司），IEC-CL31R型离心机（美国Thermo Fisher公司），NAVISO型流式细胞仪（美国Bechman Coulter公司），JCSO344型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama公司）。

2 试验办法

2.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞培育

参考文献[6-7]进行无血清培育基的制备及人肝癌HepG2肿瘤球干细胞的培育和传代。

2.1.1 无血清干细胞培育基制备 在DMEM/F12培育基中增加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。

2.1.2 细胞培育 正常培育人肝癌HepG2细胞，胰酶消化无血清培育基重悬，计数，稀释为2×103/mL，2.5 mL/孔，则5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培育箱中培育。1 d后可调查到有悬浮细胞球构成。每3 d半量换液。

2.1.3 细胞传代 当细胞构成悬浮细胞球（约6 d），进行传代培育。将含细胞培育液悬浮细胞搜集于离心管中，800 r/min离心5 min，1 mL胰酶代替物TrypLE Express消化，加胰酶时吹打几下稍等片刻，即可加PBS稀释，离心洗刷2～3次后无血清培育基重悬，再取适量加无血清培育基稀释培育。

2.2 分组和给药

正常组：DMEM培育基；对照组：DMEM培育基（含0.01%DMSO）；5-FU组：10 μg/mL 5-FU；BA各剂量组：DMSO为溶剂制备40 mmol/L BA，试验进程中以1000倍培育液稀释为40 μmol/L，一起等比对倍稀释别离得到浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培育液。

2.3 细胞自我更新才能验证

搜集肿瘤干细胞，无血清培育基稀释为每毫升500个。在低吸附96孔板上每孔参加150 μL无血清培育基，并将稀释好的肿瘤干细胞2 μL/孔参加96孔板。镜下调查，选取有且仅有1个细胞的孔每日摄影记载。

2.4 细胞增殖检测

将对数成长期的人肝癌HepG2肿瘤干细胞制成1×108/L的细胞悬液，接种于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培育箱中培育，24 h后替换不含细胞因子的DMEM/F12培育基同步化使细胞处于G0期，24 h后分组处理，别离培育于BA浓度为40、20、10、5 μmol/L的无血清培育基中，每组设5个复孔，持续培育。48 h后弃上清液，PBS冲刷1遍后每孔参加制造好的CCK-8试剂120 μL，培育箱中持续孵育2 h。将显色完结的液体搬运至正常96孔板中，于酶标仪波长490 nm处检测吸光度（OD）值。核算细胞按捺率。细胞按捺率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）÷对照孔OD值×100%。

2.5 细胞周期检测

将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶代替物消化，无血清培育液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞安稳成球，将各孔悬浮细胞培育液搬运至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培育液，PBS冲刷1遍，参加无血清培育基进行同步化。24 h后按上述办法离心，吸弃无血清培育基，依照分组给药。药物效果48 h后，将各组细胞培育液搜集到离心管中。1000×g离心3～5 min，沉积细胞。吸除上清，参加约1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并搬运至1.5 mL离心管中。再次离心沉积细胞，弃上清，参加1 mL冰浴预冷的70%乙醇，悄悄吹打均匀，4 ℃固定，过夜。离心，沉积细胞，弃上清液，用1 mL冰浴PBS冲刷1遍。每管细胞样品中参加0.5 mL碘化丙啶染色液，缓慢并充沛重悬细胞，37 ℃避光温浴30 min，24 h内流式细胞仪检测。

2.6 细胞凋亡检测

将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶代替物消化，无血清培育液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞安稳成球，将各孔悬浮细胞培育液搬运至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培育液，PBS冲刷1遍，参加无血清培育基进行同步化。24 h后按上述办法离心，吸弃无血清培育基，依照分组给药。药物效果48 h后，将各组细胞培育液搜集到离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃上清液，参加1 mL冰浴预冷的PBS冲刷细胞2次。用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106/mL的悬液，汲取上述悬液100 μL至Falcon试管，参加FITC Annexin V和碘化丙啶染料，悄悄涡旋，室温避光放置15 min后，别离参加1×Binding Buffer缓冲液400 μL，1 h内流式细胞仪检测，严厉依照凋亡试剂盒阐明书进行操作。

3 计算学办法

选用SPSS17.0计算软件进行剖析。计量材料以—x±s标明，各组数据经过正态性散布查验和方差齐性查验后，组间比较选用方差剖析或许非参数查验法。P<0.05标明差异有计算学含义。

4 成果

4.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞自我更新才能

选取有且仅有1个细胞的孔接连调查，第6日可看到细胞增殖，第8日细胞增殖数目显着增多。成果见图1。

5 评论

BA是一种五环三萜类化合物，最早发现于桦木属植物白桦的树皮中。研讨发现，BA具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种药理活性[8]，其间抗肿瘤是该化学成分的首要药理效果。20世纪90年代，科学家对2500种植物提取物进行抗癌活性试验，发现BA对人黑色素瘤具有选择性的抗癌活性[9]，随后在乳腺癌、脑癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等常见肿瘤中均验证了BA的抗肿瘤效果[10]。与BA对多种肿瘤具有潜在毒性不同的是，非肿瘤细胞及正常安排对BA有相对抵抗性[11]。 现在关于BA的抗肿瘤效果及机制已进行了许多研讨，但有关该化学成分对肝癌的效果研讨至今还未见报导。因而，本试验调查对无血清培育的人肝癌HepG2肿瘤干细胞的自我更新才能进行了验证。其次，CCK-8试验成果显现，BA效果48 h后，对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖生机按捺效果增强，并呈显着的量-效联络。咱们前期研讨发现，BA对HepG2细胞的IC50为19.68 μmol/L，而该试验中BA效果于HepG2干细胞48 h的IC50为18.30 μmol/L，标明BA在按捺HepG2干細胞与HepG2细胞的增殖生机上效果类似。咱们经过流式细胞仪进行细胞周期检测发现，高浓度BA（40 μmol/L）能按捺HepG2肿瘤干细胞从S期进入G2/M期，将其阻滞于S期，标明高浓度BA经过按捺DNA的组成按捺HepG2细胞的成长。而5-FU则是将HepG2干细胞周期阻滞于G0/G1期来按捺细胞增殖，标明BA与5-FU对HepG2干细胞具有不同的效果途径，其分子机制有待进一步研讨。

细胞凋亡是正常的生理进程，此进程中，细胞膜坚持完好，胞内物质不释放出胞外，不引发胞外安排的炎性反应[12]。有研讨标明，BA经过诱导黑色素瘤细胞的凋亡发挥其抗肿瘤效果。蒋孟军等[13]以为，BA可以体外按捺胰腺癌细胞的成长并诱导细胞凋亡。Chakraborty B等[14]也发现，BA衍生物是人结肠癌细胞HT-29细胞凋亡的诱导剂。一起，本试验也发现，BA可显着诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡，且具有显着的浓度依赖性。40 μmol/L BA效果于HepG2细胞后，其凋亡率可达10.86%，可见BA的抗肿瘤效果与诱导细胞凋亡有亲近的联络。

细胞凋亡与细胞周期之间有许多潜在的联络，一般细胞先被阻滞于细胞的某一周期，然后诱导其发作凋亡，现在许多肿瘤化疗药物正是经过细胞周期阻滞来诱导细胞凋亡，然后到达医治肿瘤的意图。蒋孟军等[13]研讨标明，BA将胰腺癌细胞阻滞于G0期来诱导其凋亡。Foo J B等[15]发现，BA作为黄花第伦桃二氯甲烷提取物的首要成分，经过p53/p21通路将乳腺癌MCF-7细胞阻滞于G0/G1期。但本试验发现，低浓度BA（5～20 μmol/L）简直对细胞周期没有影响，而对HepG2细胞的凋亡率效果明显，可见BA对HepG2肿瘤干细胞的凋亡与周期阻断并无特定联络。高浓度处理的细胞被阻滞于S期，阐明BA经过S期阻断而诱导细胞凋亡，这或许是BA诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡效果途径的一部分，而低浓度BA诱导凋亡的效果方法并未经过细胞周期阻滞完成，这与高浓度BA诱导凋亡的途径不同。因而，BA诱导HepG2干细胞的细胞凋亡或许是多途径的杂乱进程，BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞的增殖按捺效果仍有待于进一步研讨。

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（收稿日期：2016-04-20）

（修回日期：2016-05-05；修改：华强）