在体肠灌流 采用在体单向肠灌流模型研讨荷叶多成分全体的肠渗透性
尹秀文+侯成波+陈江鹏+潘孟+李雪莲+王子禹+董玲
[摘要] 研讨荷叶多成分全体的肠浸透性，清晰荷叶成分间吸收进程中的相互效果。选用大鼠在体单向灌流法。成果表明，荷叶中荷叶碱、去甲基荷叶碱、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚7种单体成分的有用浸透系数（Peff）大于0.5×10-4 cm·s-1，在生物药剂学分类体系（biopharmaceutics classification system，BCS）肠浸透特点中，属高浸透性成分，而儿茶素、金丝桃苷为低浸透性成分。可是，在荷叶总提取物多成分环境下，成分的浸透行为发作了改动，对荷叶中不清晰成分进行半定量剖析发现，在多成分环境下，可标识的9个成分中有3个成分Peff小于0.5×10-4 cm·s-1。在多成分环境下，7个不知道成分中，3个成分归于高浸透性成分，4个成分归于低浸透性成分。该研讨开始清晰了荷叶中多成分全体的肠浸透性，为提醒中药多成分环境下的吸收机制奠定必定的根底。
[关键词] 单向肠灌流；浸透性；荷叶；中药生物药剂学分类体系
Overall intestinal permeability of multiple components in
lotus leaf by in situ single pass intestinal perfusion models
YIN Xiu-wen， HOU Cheng-bo， CHEN Jiang-peng， PAN Meng， LI Xue-lian，WANG Zi-yu， DONG Ling*
（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）
[Abstract] To investigate the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaves and make clear the interaction in composition absorption process. Rat single-pass intestinal perfusion technique was used， and the results showed that the Peff values of nuciferine， demethylanuciferine， rutin， quercetin， kaempferol from lotus leaf were greater than 0.5×10-4 cm·s-1. In the biopharmaceutics classification system （BCS） intestinal permeability property， these ingredients were high permeable components， while the hyperin was low permeable component. However， in the multi-component environment of the lotus leaf extract， component permeation was changed. Semi quantitative analysis of the unclear components showed that under the multi-component environment， four in seven components with relatively high contents had a Peff value less than 0.5×10-4 cm·s-1， indicating these 4 components were of low permeability， while other 3 components were of high permeability. The results could be valuable to make clear the overall intestinal permeability of multiple components in lotus leaf， and lay a foundation for studying the mechanism of the lipid-lowering effect of lotus leaf.
[Key words] single-pass intestinal perfusion（SPIP）； permeability； lotus leaf； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica
口服作為药物最常见的服用办法，其胃肠道吸收进程十分杂乱。药物的水溶解性及肠浸透性是影响吸收的首要要素[1]，也是影响药物生物利费用的关键要素之一。“生物药剂学分类体系（biopharmaceutics classification system，BCS）”是依据药物的水溶解性及肠浸透性凹凸，对药物进行分类的一种科学结构或办法[2-3]。BCS的提出是依据单一成分化学药物，而中药与化药口服吸收的实质和中心是共同的。成分在肠道吸收受许多要素影响，对中药全体肠吸收研讨，需求通过单成分到多成分环境的递进进程，才干清晰成分在多成分环境下的吸收改动差异。依据中药的多成分特点本课题组提出了中药生物药剂学分类体系（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）[4]。本文在研讨中药多成分环境下的浸透性时，首要要对吸收的方针成分进行确定，一起要充分考虑多成分环境下其他成分对方针成分的影响，然后再对吸收成分的吸收程度进行体系剖析和定量研讨。
小肠是药物吸收的重要部位，现在，猜测药物小肠吸收的办法首要有分为体外法、离体法、在体法3种[5-7]。体外法首要有Caco-2细胞模型、平行人工膜等，离体法首要选用翻转肠囊实验，离体规则触及翻转肠囊法。体内法一般选用经典的单向肠灌流法、以及肠灌流并行采血法。本课题组前期通过离体法翻转肠囊实验研讨了荷叶中荷叶碱、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、紫云英苷的肠浸透性，但由于儿茶素、去甲基荷叶碱，山柰酚等成分在荷叶总提取物中含量自身比较低，翻转肠囊实验未能进一步探究其肠浸透状况，该办法对成分的判别有失精确[8]。为了进一步对荷叶成分进行肠浸透性定量剖析，本研讨选用大鼠在体单向肠灌流（SPIP）实验对荷叶中确定单成分进行灌流实验，该办法较好地模仿人体的体内环境，不损害研讨部位的循环体系和生理环境，且成果与人体实验成果相关性杰出[9-10]。古籍记载荷叶具有瘦身降脂的成效[11]，荷叶多成分是通过多靶点发挥降脂瘦身效果[12-14]。本研讨选用荷叶为研讨目标，选用在体单向肠灌流模型，研讨荷叶多成分全体的肠浸透性，清晰荷叶多成分中的易吸收透过肠壁和难于透过肠壁屏障的成分，为中药生物药剂学分类体系的后续研讨供给必定的理论和技能参阅。
1 资料
1.1 仪器
LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-20A型紫外检测器，SIL-20A自动进样器，日本岛津公司）；BT-25S电子剖析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DZKW-4 电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山超聲仪器有限公司）；STARTER2100实验室pH计（奥豪斯仪器上海有限公司）；打针泵（LSP02-1B，保定兰格恒流泵有限公司）；高速冷冻离心机（GL-21M，上海沪湘仪离心机有限公司）。
1.2 药物与试剂
荷叶药材购自我国北京同仁堂（集团）有限责任公司，经北京中医药大学王晶娟副教授鉴定为睡莲科植物莲Nelumbo nuifera Gaertn的枯燥叶，对照品叶碱（批号J04M6Y1，上海源叶生物科技有限公司）、芦丁（批号Y05M6S1，上海源叶生物科技有限公司）、金丝桃苷（批号08916-418，美国ChromaDex）、异槲皮苷（批号HJ0604XA13，上海源叶生物科技有限公司）、槲皮素（批号Y26D5Y1，上海源叶生物科技有限公司）、紫云英苷（批号KS0910CB14，上海源叶生物科技有限公司）；乙腈购买于美国Fisher公司（色谱级）；磷酸、氯化镁、氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖购买于北京化工厂（剖析级）；娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司（我国杭州）。
1.3 动物
SD大鼠，雄性，体重200～250 g，斯贝福（北京）实验动物科技有限公司供给，许可证号SCXK（京）2011-0004。
2 办法
2.1 溶液制造
2.1.1 对照品溶液
精细称取各对照品5.0 mg于10 mL量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀，得500 mg·L-1对照品储藏液。精细量取各储藏液3.0 mL于50 mL量瓶，甲醇稀释至刻度，摇匀后，精细量取各对照品适量于50 mL量瓶，甲醇定容，摇匀，即得必定浓度的混合对照品溶液。
2.1.2 Krebs-Ringer′s营养液（K-R液）
称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去离子水定容至1 000 mL，即得。
2.1.3 荷叶提取物溶液的制备
荷叶药材破坏，得粗粉，称取5 g，以60%乙醇固料比1∶30回流提取1 h，提取液趁热抽滤，放冷定容至250 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC剖析。
2.1.4 灌流液制备
称取适量的荷叶对照品，以K-R液溶解得到不同浓度的肠灌流液。取荷叶醇提液用K-R液稀释至必定生药浓度的灌流液。
2.2 荷叶多成分HPLC剖析办法的树立
2.2.1 色谱条件
2.2.1.1 荷叶可标识单成分色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温30 ℃；进样量20 μL；活动相水（A，含0.025%磷酸）-乙腈（B），梯度洗脱。各成分检测波长、流速、活动相份额见表1。
2.2.1.2 荷叶提取物色谱条件 Phenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长270 nm；流速0.8 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL；活动相0.025%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱 （0～2 min，98∶2；2～5 min，98∶2～92∶8；5～8 min，92∶8；8～11 min，92∶8～88∶12；11～17 min，88∶12；17～25 min，88∶12～85∶15；25～43 min，85∶15；43～61 min，85∶15～74∶26；61～70 min，74∶26；70～89 min，74∶26～25∶75；89～90 min，25∶75；90～98 min，25∶75～98∶2；98～120 min，98∶2）。
2.2.2 定量剖析办法学调查
2.2.2.1 专特点调查 荷叶可标识单成分：别离取空白肠灌流液、含对照品灌流液进行HPLC检测剖析，空白肠灌流液对荷叶定量成分检测无影响，阐明办法专特点杰出，成果见图1。
荷叶多成分：别离取空白肠灌流液、含糊标对照品灌流液进行HPLC检测剖析，空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响，阐明办法专特点杰出，成果见图2。
2.2.2.2 线性与规模 荷叶可标识单成分：别离量取必定体积0.5 g·L-1的对照品储藏液于容量瓶中并定容，配成不同浓度的对照品溶液，别离精细取上述对照品溶液20 μL注入高效液相，记载各成分峰面积，以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。成果表明各对照品在相应浓度规模内线性联系杰出，见表2。
荷叶多成分：别离量取必定体积0.5 g·L-1的对照品储藏液于量瓶中并定容，配成不同浓度的混标溶液，别离精细取上述混标溶液20 μL注入高效液相，记载峰面积，以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归。成果表明各对照品在相应浓度规模内线性联系杰出，成果见表3。
2.2.2.3 精细度调查 荷叶可标识单成分：别离制造不同浓度的对照品溶液，重复进样6 针，记载峰面积，核算RSD。各浓度下RSD均小于2%，阐明办法精细度杰出。
荷叶多成分：别离制造不同浓度的混合对照品溶液，重复进样6针，记载峰面积，核算RSD。各浓度下，RSD均小于2%，阐明办法精细度杰出。
2.2.2.4 重复性调查 荷叶可标识单成分：别离精细量取对照品母液于50 mL量瓶，以K-R′s试液定容，摇匀后，以甲醇稀释至必定份额，样品通过0.22 μm微孔滤膜后进行HPLC检测，记载峰面积，并核算RSD，一切样品重复操作5次。成果表明RSD均小于2%，阐明办法重复性杰出。
荷叶多成分：别离精细量取对照品母液于50 mL量瓶，以K-R′s试液定容，摇匀后即得必定濃度的混合对照品溶液，以甲醇稀释至必定份额，样品过膜后进行HPLC检测，记载峰面积，核算RSD，样品重复操作6次。成果RSD<3%，阐明办法重复性杰出。
2.2.2.5 回收率调查 荷叶可标识单成分：取空白肠灌流液，别离参加不同量的对照品，以HPLC测定其含量，核算回收率，样品回收率RSD在95.28%～100.8%，阐明办法精确度杰出。
荷叶多成分加样回收率调查：取目标成分已知浓度的荷叶提取物肠灌流液，别离参加不同量的对照品，以HPLC测定其含量，核算回收率，成果表明回收率在86.85%～105.7%。
2.3 荷叶单成分肠浸透性研讨
2.3.1 大鼠在体肠灌流操作办法
大鼠禁食不由水12～18 h，腹腔打针10%水合氯醛（3 μL·g-1）麻醉。沿中线翻开腹部，选取适宜长度肠段，用生理盐水冲刷洁净。打针泵与肠段进口端相连，设置灌流速度为0.2 mL·min-1，继续灌流约30 min吸收到达安稳后从头计时，每隔15 min用已知质量的小瓶在肠段出口端搜集流出药液，核算搜集前后小瓶分量称量差，一起测定搜集液的密度，以此办法来进行灌流液的体积校对。实验完毕后剪下被灌流的肠段并处死大鼠，丈量肠段的长度及内径。HPLC测定流出灌流液中待测成分含量。
2.3.2 在体单向肠灌流法相关核算办法[15]
在体灌流法肠有用浸透系数Peff核算公式如下。
Peff=-Qin·ln（Cout（cor）/C0）2πrL
Qout=Mout/Doutt
Cout（cor）=CoutQoutQin
Qin为灌流液流速（mL·min-1）；C0为灌流液荷叶成分的初始浓度（mg·L-1）；L是灌流肠段长度（cm）；r为灌流肠段半径（cm）；Cout（cor）荷叶成分灌流搜集液校对浓度（mg·L-1）；Qout为灌流液流出的流速（mL·min-1）；Cout为灌流搜集液中荷叶成分的浓度（mg·L-1）；Dout为灌流搜集液密度（g·mL-1）；t为取样周期（min）；Mout为灌流搜集液质量（g）。
3 成果
3.1 荷叶可标识单成分、多成分HPLC图的树立
3.1.1 荷叶可标识单成分HPLC图的树立
3.1.1.1 荷叶可标识单成分HPLC图 本研讨树立了荷叶可标识单成分HPLC图谱，空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响，阐明办法专特点杰出，成果见图1。
3.1.1.2 荷叶可标识单成分规范曲线制作 以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，成果表明各对照品在相应浓度规模内线性联系杰出，见表2，
3.1.2 荷叶多成分HPLC图的树立
3.1.2.1 荷叶多成分HPLC图 为了调查荷叶成分吸收改动状况，本研讨树立了荷叶化学成分HPLC图谱，空白肠灌流液、荷叶总提取物溶液对荷叶定量成分检测无影响，阐明办法专特点杰出，成果见图1。
3.1.2.2 荷叶多成分规范曲线制作 以药物质量浓度X（mg·L-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，成果表明各对照品在相应浓度规模内线性联系杰出，见表3。
3.2 荷叶多成分肠浸透性研讨
3.2.1 荷叶可标识单成分吸收
选用在体单向灌流对荷叶中清晰的单成分进行浸透性研讨，荷叶中可标识单体成分有用浸透系数见表4，能够看出荷叶中荷叶碱、去甲基荷叶碱、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚成分Peff大于0.5 ×10-4cm·s-1，在BCS肠浸透特点中，这些成分为高浸透性成分，而儿茶素、金丝桃苷为低浸透性成分。
3.2.2 荷叶提取物吸收状况
3.2.2.1 荷叶提取物中可标识成分吸收状况 在荷叶多成分环境下，可标识成分有用浸透系数见表5，成果表明，单成分仅有儿茶素、金丝桃苷是低浸透性药物成分，可是在多成分环境下，成分的浸透行为并不是原封不动的，去甲基荷叶碱与芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷等荷叶黄酮苷类成分全体浸透率有下降的趋势，芦丁的浸透系数呈现了跨象限的现象，多成分环境下，芦丁成分由高浸透性变为低浸透性，而山柰酚浸透系数则增大。
3.2.2.2 荷叶提取物中不行标识成分吸收状况 由HPLC图，选取已知成分异槲皮苷作为内标物，核算其他较高含量成分的相对保存时刻及相对含量，并核算其肠有用浸透系数，成果见图3，表6。
成果表明，其他含量比较高的成分中7个成分中，X1，X2，X6的Peff大于0.5×10-4 cm·s-1，依据BCS归于高浸透性成分，成分X3，X4，X5，X7则低于该值，归于BCS的低浸透性成分。
4 评论
4.1 荷叶全体肠浸透性实验成果与评论
对荷叶中已知的单成分进行了肠浸透性调查，既定成分已经有了比较清晰的肠浸透归属，9个成分中仅有儿茶素与金丝桃苷的Peff小于0.5×10-4 cm·s-1，其他成分均大于该极限，儿茶素与金丝桃苷归于低浸透性成分，而其他成分为高浸透性成分。可是，在荷叶总提取物这一杂乱环境下，对应成分的肠浸透性状况或许会发作改动，最为明显的是芦丁的浸透系数呈现了跨象限的现象，多成分环境下，芦丁成分由高浸透性变为低浸透性，多成分环境下，荷叶中的去甲基荷叶碱与芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷等荷叶黄酮苷类成分全体浸透率有下降的趋势，而山柰酚浸透系数增大，或许是其他成分促渗效果导致。因而，研讨清楚荷叶多成分在全体环境下的肠浸透性，清晰多成分环境下成分吸收改动规则具有重要的含义。
4.2 依据肠浸透性的成分吸收点评研讨
肠浸透性是药物进行BCS分类的根本特点之一[16]，依据其强弱将药物分为高浸透性药物（强吸收成分）和低浸透性药物（弱吸收成分）[2]。就中药而言，中药成分自身浸透性有差异，一起多成分环境下也会导致浸透性发作差异，因而在调查成分浸透性时，要一起调查对单成分浸透行为和全体多成分环境对浸透性的影响。药物的浸透性差异，其吸收行为就有差异，必定导致其发挥药效的机制不同，关于高浸透性的药物，药物多是吸收进入体内发挥效果，而关于低浸透性药物，则多是停留在肠道内，因而在研讨药物发挥效果的机制时，关于肠浸透性差的药物，能够考虑依据肠道吸收前靶点的活性研讨，而关于肠浸透性较好的药物成分，考虑其在吸收进程中以及吸收后靶点药效研讨。
荷叶是经典的药食两用的瘦身药材，降脂瘦身的临床成效得到遍及认可，荷叶中含有很多的瘦身有用成分，首要是生物碱类和黄酮类成分，还有多酚类、有机酸类成分等[17]。但其发挥瘦身效果的机制尚不清晰，其间脂肪酶按捺是十分典型降脂瘦身机制，针对荷叶生物碱、黄酮总提取物以及部分单体成分的脂肪酶按捺活性已经有研讨[18]，但各成分之间协同效果，怎么发挥效果，未见文献报导。为了清晰荷叶多成分的瘦身降脂机制，首要对荷叶进行吸收行为调查，成果发现，荷叶多成分中有浸透性好的成分，也有肠浸透性差的成分，且多成分环境下肠浸透性遭到成分间相互效果影响发作改动。因而，研讨荷叶发挥降脂的机制，低浸透性成分或许因在肠道停留时刻长，结合像脂肪酶相同的肠道吸收前靶点发挥效果，而高浸透性成分如荷叶碱，或许是吸收进程中或吸收进入体内通过其他降脂靶点发挥效果，除此之外，还要考虑荷叶多成分在发挥药效时的相互影响。综上所述，荷叶发挥瘦身降脂的机制及其联系，需进一步研讨。
[参阅文献]
[1] Ruiz-Garcia A，Bermejo M，Moss A，et al.Pharmacokinetics in drug discovery[J]. J Pharm Sci， 2008，97（2）：654.
[2] Amidon K S，Langguth P，Lennerns H，et al. Bioequivalence of oral products and the biopharmaceutics classification system： science，regulation，and public policy[J]. Clin Pharmacol Ther， 2011，90（3）： 467.
[3] Oh D M，Curl R L，Amidon G L. Estimating the fraction dose absorbed from suspensions of poorly soluble compounds in humans： a mathematical model[J]. Pharm Res，1993，10（2）：264.
[4] 刘洋，隗丽，董玲，等.多成分体系下中药生物药剂学分类体系的构建剖析[J]. 我国中药杂志，2014，39（23）：4479.
[5] 廖正根，平其能，萧伟，等. 桂枝茯苓胶囊中有用成分的大鼠在体肠吸收研讨[J]. 我国天然药物，2005，3（5）： 303.
[6] Kansy M，Senner F，Gubernator K. Physicochemical high throughput screening： parallel artificial membrane permeation assay in the description of passive absorption processes[J]. J Med Chem，1998，41（7）： 1007.
[7] Li H，Dong L，Liu Y，et al. Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats[J]. Int J Pharm，2014，466（1）： 133.
[8] 侯成波，董月柳，尹秀文，等. 荷叶多成分全体的肠浸透性研讨[J]. 我国中药杂志，2016，41（7）：1183.
[9] Chen X M，Li J S，Li W，et al. Intestinal absorption of the effective components of Schisandra chinensis Baill by rats single-pass perfusion in situ [J]. Acta Pharm Sin，2010，45： 652.
[10] Zakeri-Milani P，Valizadeh H，Tajerzadeh H，et al. Predicting human intestinal permeability using single-pass intestinal perfusion in rat[J].J Pharm Pharm Sci，2007，10： 368.
[11] 陶帅，景贤，吴凤莲.荷叶水煎剂对高脂血症大鼠血脂及血液流变学的影响[J]. 中医药学报，2000（6）：55.
[12] 范婷婷，法鲁克，方芳，等.荷叶总生物碱降脂瘦身效果的体表里实验[J].浙江大学学报：农业与生命科学版，2013（2）：141.
[13] 孙晨光.论荷叶的瘦身降脂效果[J].中医临床研讨，2014（3）：100.
[14] 薛冬娜.荷叶总黄酮提取纯化工艺及瘦身降脂效果的研讨[D].重庆：西南大学，2008.
[15] Li H，Dong L，Liu Y，et al. Comparison of two approaches of intestinal absorption by puerarin[J]. J Pharmacol Toxicol Methods，2014，70（1）： 6.
[16] Amidon G L，Lennerns H，Shah V P，et al. A theoretical basis for a biopharmaceutics drug classification： the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability [J]. Pharm Res，1995，12（3）：413.
[17] 王玲玲，劉斌，石任兵.荷叶的化学成分研讨[J].天然产品研讨与开发，2009（3）：416.
[18] 范婷婷，法鲁克，方芳，等.荷叶总生物碱降脂瘦身效果的体表里实验[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2013（2）：141.
[责任编辑 孔晶晶]