用于衡量挥发油的首要化学常数 紫苏叶挥发油化学型和组分影响要素探求Ⅰ——不同成长发育期
魏长玲+张琛武+郭宝林+李卫萍+高占祥+张芬+田景
[摘要] 该论文以遍及存在的PK型、PA型及稀有的PL型3種紫苏种质为研讨目标。在紫苏成长的养分期、开花期、果熟期3个时期进行紫苏老练叶样品搜集，一起分为1 d之中早7点、午12点、晚18点3个时刻点，对其蒸腾油进行了提取（水蒸汽蒸馏法）和GC-MS剖析，3种化学型的样品蒸腾油得率在0.08%～0.96%，不同成长时期蒸腾油得率大致为养分期>开花期>落叶期，养分期蒸腾油得率：PA型>PK型>PL型。各化学型类别不受成长发育影响，标明遗传要素决议了化学型。PA和PK型的特征成分和首要成分相对含量都比较安稳，而PL型的特征成分随成长发育大起伏下降，组成中还存在很多各类成分代谢的上游化合物，标明该化学型或许具有原始性和多变性。PA型特征成分紫苏醛相对含量各个时期基本上从早到晚逐步下降。PK型特征成分紫苏酮在养分期和开花期正午相对含量高于迟早样品，果熟期则相反。PL型特征成分紫苏烯相对含量在养分期和果熟期都是正午最高，开花期则是黄昏样品最高。归纳蒸腾油得率和首要成分相对含量，PA型的最佳采收时刻在养分期的早晨采收；PK型的最佳采收期在各期午前均可；PL型的最佳采收期在养分期的晚上采收最好。
[关键词] 紫苏； 蒸腾油； 紫苏醛型； 紫苏酮型； 紫苏烯型； 成长发育时期； 相对含量改变
[Abstract] This experiment researched on three kinds of Perilla frutescens including the widespread PK， PA and rare PL chemotype. The Perilla samples were the mature leaves collected in nutrition， flowering and frutescence three different phenological periods， and at 7 am， 12 pm and 6 pm three day time. The volatile oil was extracted by steam distillationand analyzed by GC-MS， as a result， the three chemotype samples′volatile oil yield was between 0.08% and 0.96%； volatile oil yield of different growth period was as follow： nutrition>flowering>fructescence， and the volatile oil yield of nutrition period： PA type>PK type>PL type. Each chemotype was not affected by the growth and development， indicating that the chemotype is determined by genetic factors. Characteristic and main components of PA and PK type are relatively stable， and the characteristic components of PL type are significantly decreased with the growth. There are still a large number of upstream metabolism components， and the chemical type may have their primitiveness and changeability. The relative content of perillaldehyde， characteristic components of PA type， is basically decreased from morning to night， in all the period. The relative content of perillaketone， characteristic components of PK type， in nutrition and flowering period， when samples were collected at 12 noon is relatively higher than that at 7 am and 6 pm， and contrary to samples collected in frutescence period. The relative content of perillene， characteristic components of PL type， in nutrition and frutescence period are highest at 12 noon， while in flowering period is highest at 6 pm. According to the volatile oil yield and relative content of maincomponents， the best harvest time of PA type is in the morning of the nutrition period； the best harvest time of PK type is in the morning of all the period； and the best harvest time of PL type is at dusk of the nutrition period.
[Key words] Perilla frutescens； volatile oil； perillaldehyde chemotype（PA）； perillaketone chemotype（PK）； perillene chemotype（PL）； phenological period； changes of relative content
紫蘇叶因存在不同的蒸腾油化学型然后导致药用时活性存在差异。本试验在前期对国内紫苏资源查询和化学型归类剖析的根底上[1-2]，挑选了国内资源中遍及存在的紫苏醛型（PA型）和紫苏酮型（PK型），以及《我国药典》藿香正气液项下的紫苏叶油规范中触及的紫苏烯型（PL型）3种不同化学型的紫苏[3]，研讨它们不同在成长发育期、一天不一起间段的叶中蒸腾油化学型和构成蒸腾油组分的改变，并评论或许的规则。
1 资料
1.1 仪器和试剂 GC-MS（7890B-5977A）气相质谱联用仪器（Agilent安捷伦公司）；旋转蒸腾仪（EYELA N-1100 上海爱朗仪器有限公司）；剖析天平（FA2014N型，上海精细科学仪器有限公司）；循环式真空泵（CA-1111上海爱朗仪器有限公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
蒸馏水，石油醚（剖析纯，北京化工厂）；正己烷（色谱纯，fisher公司）无水乙醇（剖析纯，北京化工厂）。
1.2 样品 3份不同蒸腾油化学型的紫苏种子均来自经查询后断定的培养紫苏主产区：PK型种子来自甘肃省庆阳市，PA型和PL型种子均来自重庆市，搜集于2015年3月，培养于我国医学科学院药用植物研讨所培养试验田。3份种子以其对应的化学型名称为编号。播种期5月8日，出苗期5月17日左右。3个成长时期搜集老练叶样品，①养分成长期（简称养分期）：养分成长旺盛时期，植株高度约达终究高度的2/3，PK型样品搜集于7月23日，PA型和PL型样品搜集于8月20日；②开花期：花序上对折以上花敞开，PK型样品搜集于9月15日，PA型和PL型样品搜集于10月8日；③果熟期：果序上对折果实老练，植株下部叶片开端发黄和掉落，PK型样品搜集于10月8日，PA型和PL型样品搜集于10月19日，每1个成长期，又分为早晨7时（简称早）、正午12时（简称午）和黄昏18时（简称晚）3个时刻点取样。叶片均搜集自植株中部的老练叶片，每个样品约60个单株的混合，阴干，阴凉处寄存。
2 办法
蒸腾油提取和GC-MS剖析拜见文献[2]。
3 成果和评论
紫苏叶PA，PK，PL 3个化学型在养分期、开花期、果熟期3个时期蒸腾油得率及GC-MS剖析成果别离见表1～3。
3.1 蒸腾油得率的改变 PA型各成长时期蒸腾油得率均体现为：成长发育期对蒸腾油得率影响很大，养分期开花期>果熟期；从1 d的不一起间点看，养分期：早中≈晚；而开花期和果熟期：早≈中>晚。
PK型各成长时期蒸腾油得率均体现为：养分期≈开花期>果熟期，下降起伏不大。从1 d的不一起间点看，养分期：早≈中>晚，而开花期和果熟期：早<中，中>晚，开花期迟早差不多，而果熟期的早晨蒸腾油很低0.08%，是较为特别的成果。
PL型在各成长时期蒸腾油得率大体体现为：养分期>开花期≈果熟期，下降起伏不大。从1 d的不一起间点看，养分期：早>午晚，开花期：早≈午晚，果熟期：早≈午<晚，在2个发育期体现为晚上得率最高，是有意思的现象。
本成果支撑紫苏叶搜集时刻一般应为养分期或花前期，而不应在果熟期搜集，其间PA型对搜集时期十分灵敏，而PL型次之，PK型紫苏则养分期直至花期搜集均可。在合适搜集期里，PA型应该在早晨搜集，PK型则从早到午搜集均可，PL型却在黄昏搜集最好。
3.2 蒸腾油组成改变 3种化学型样品，在各成长发育期的化学型类型是安稳的，且石竹烯（caryophyllene）为3个化学型各时期共有的较高含量成分，与以往关于PA型和PK型的报导一起[4-7]。
PA型蒸腾油组成可分为4个首要部分，榜首部分是该化学型的特征成分紫苏醛（perillaldehyde）、D-柠檬烯（D-limonene），以及和该化学型代谢相关的几个单萜： trans-shisool、紫苏醇（perilla alcohol），紫苏醛的相对含量大多在50%左右，花期的相对含量稍高，D-柠檬烯是紫苏醛代谢直接上游化合物，在3个成长发育期大致是逐步下降的趋势，其间在开花期和果熟期的黄昏都低于2%；其他几个成分中，紫苏醇和trans-shisool则在果熟期添加较多，如trans-shisool在其他时期1.45%～3.36%，果熟期则为3.84%～4.95%，紫苏醇在养分期未检测到，花期低于1%，到果熟期黄昏则到达8.14%；第二部分是倍半萜类成分，包含石竹烯、α-佛手柑油烯（α-bergamotene）、葎草烯（humulene）、大根香叶烯D（germacrene D）、γ-榄香烯（γ-elemene）、石竹烯氧化物
（caryphyllene oxide）和α-法尼烯（α-farnesene），石竹烯在悉数样品中相对含量改变不大，15.61%～17.77%，α-佛手柑油烯在果熟期较其他时期相对含量高，其他几个成分大多是果熟期略有添加，α-法尼烯含量较低（0～1.11%）；第三部分为该化学型中一般不会出现的单萜成分，如PK型的紫苏酮（perillaketone）、PL型的紫苏烯（perillen）仅在开花期检出紫苏酮（开花期午1.05%，晚4.39%）和紫苏烯（开花期晚1.16%）；第四部分是芳香类化学型PP型的构成成分及相关成分，肉豆蔻醚（myristicin）及其上游代谢成分丁香酚（eugenol），肉豆蔻醚则在3个发育时期的9个时刻点中6个时刻点检出，且含量巨细没有规则，如开花期仅在黄昏检出，而含量却最高（7.61%），丁香酚仅在开花期和果熟期的正午和黄昏检出。还有紫苏中所有单萜类成分代谢的一起上游成分芳樟醇（linalool），在各个时刻点均有检出（0.72%～3.76%），相对含量大致出现随发育期逐步下降。
PK型蒸腾油组成可分为3个首要部分，榜首部分是该化学型的特征成分紫苏酮（perillaketone），以及代谢相关的白苏烯酮（egomaketone），紫苏酮的相对含量在48%～70%，养分期（约50%）<开花期（约60%）<果熟期（67%以上），一天的不一起间点，则养分期和开花期是正午最高，果熟期反而是正午最低，白苏烯酮是紫苏酮代谢的前体化合物，相对含量正好与紫苏酮相反，且改变起伏比较大，养分期（36%以上）>开花期（大约22%）>果熟期（大约15%）；第二部分也是倍半萜类成分，包含与PA型共有的石竹烯、α-法尼烯、葎草烯、石竹烯氧化物，以及2-丁烯二环庚烷（2-（1-buten-3-yl）-bicyclo[2.2.1]heptane）和保存时刻为11.01的不知道成分（经GC/MS软电离分子量剖析，为倍半萜成分），均相对含量改变不大。第三部分为该化学型中一般不会出现的单萜类，如PA型的D-柠檬烯，仅在开花期的正午检测出，微量（0.13%）。未检出芳香类化合物。别的上游单萜成分芳樟醇在开花期和果熟期检测到，相对量均小于1%。还有一种在植物蒸腾油中常存在的1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol），又名蘑菇醇，在开花期和果熟期检出，相对量也均小于1%。
PL型蒸腾油组成可分为4个首要部分，榜首部分是该化学型的特征成分紫苏烯，其含量在不同成长发育期体现为极大的差异，养分期（大于75%）>开花期（54.51%～60.70%）>果熟期（3.57%～24.36%）；第二个部分是倍半萜类成分，包含和PA， PK共有的石竹烯、α-佛手柑油烯、葎草烯、石竹烯氧化物、α-法尼烯，以及和PA共有的大根香叶烯D、还有反式橙花叔醇（trans-nerolidol），石竹烯、α-佛手柑油烯和大根香叶烯D在成长发育期均体现为养分期<开花期<果熟期，且改变起伏很大，如石竹烯从养分期的大约7.52%～9.31%变为果熟期的19.02%～25.71%，其他几种倍半萜或许在养分期、或许在花期未检出，或相对含量很低，而果期均相对含量均添加，且大多高于在PA和PK型中的同期状况；第三部分为其他化学型中的单萜成分，如紫苏醛、D-柠檬醛，紫苏酮，薄荷酮，均在部分时刻点的样品中检出，含量不高，也未見显着规则；第四部分为芳香类化学型中的成分，如细辛脑（asarone）、丁香酚，且含量较高。在PL型中还发现紫苏单萜成分代谢进程中的多个上游化合物，除了芳樟醇，还有顺势牻牛儿醇（cis-geraniol）、顺式柠檬醛（cis-citral）、反式柠檬醛（trans-citral），均是在部分时刻点检出。此外PL型中还检出了一些植物蒸腾油中常见成分，除了1-辛烯-3-醇，还有邻二甲苯（O-xylene）、甲基水杨酸（methyl-salicylate），也是在部分时刻点检出。
Nitta等经过杂交试验估测了紫苏叶蒸腾油中首要化学型构成成分单萜类和芳香类两类成分的生物组成途径，单萜类以甲羟戊酸（mevalonic acid）途径组成，芳香类终产物以莽草酸（shikimic acid）途径组成，两途径之间因基因操控而发作切换[8]。从生源组成途径来看，本试验的3个化学型样品均以甲羟戊酸途径组成，但在PA型样品全成长期均检出芳香类成分肉豆蔻醚、开花期和果熟期检出芳香类成分的前体化合物丁香酚，PL型样品的全成长期均检出丁香酚、果熟期检出芳香类成分细辛脑，而PK型样品各时期均未检出芳香类成分，故作者以为关于PA型和PL型，单萜类和芳香类2个组成途径之间或许并非严厉的单基因操控。紫苏烯是紫苏酮的前体化合物，但自然界PK型为最遍及的化学型，在已有报导的PK型紫苏蒸腾油中一般无紫苏烯成分或微量存在（0.8%）[9-12]，说明紫苏烯很简单转化为紫苏酮。PA型和PL型中均检出紫苏酮，而PK型中仅检出极微量的PA型特征成分D-柠檬烯，说明PK型较PA和PL型为优势（显性）化学型[10]，别的从种类和相对含量上，PK型中较少代谢上游单萜成分，而PA型较多、PL型更多，其他文献也支撑这样的状况[13]，标明几种化学型中或许PL较为原始、PA恰当进化，PK更为进化，本研讨成果为进一步评论紫苏单萜类成分的代谢操控，以及不同化学型之间的进化联系，有一些不错的提示[13]。
3.3 首要成分相对含量改变 本试验挑选了每种化学型的相对含量在前5位的化合物，比较它们在不同发育期（早晨）相对含量的改变，成果拜见图1。
PA型蒸腾油中首要成分单萜类的紫苏醛、D-柠檬烯和trans-shisool，以及倍半萜类的石竹烯、α-佛手柑油烯均体现为在不同发育期内相对含量的安稳性，标明单萜类的几种成分的转化不受成长发育影响。
PK型蒸腾油中首要成分单萜类的紫苏酮和白苏烯酮体现为随成长发育前者上升，后者下降的趋势，而二者之和相对安稳，而倍半萜类的石竹烯、α-法呢烯和石竹烯氧化物体现安稳，标明白苏烯酮转化为有条件转化，紫苏酮受成长发育较大影响。因为白苏烯酮存在于PK型紫苏中的状况较少，因而本试验样品体现出了一种特别性，可作为一种特别研讨资料。
PL型蒸腾油中首要单萜成分紫苏烯，随成长发育出现出相对含量大起伏削减的趋势。而倍半萜成分α-佛手柑油烯、石竹烯、大根香叶烯D不同于PA和PK型，相对含量均呈添加趋势。芳香类成分丁香酚相对含量也呈添加趋势。PL型中首要特征成分随成长发育的相对含量巨幅削减，而其他成分的相对含量添加，都标明PL型的化学构成的特别性，这为说明紫苏叶蒸腾成分的生物组成具有重要的价值。
4 小结
归纳成长发育期和一天不一起间点的蒸腾油得率和蒸腾油中特征成分相对含量（得率×相对含量）的改变，PA的最佳采收时刻在养分期的早晨采收；PK型的最佳采收期在开花期的正午，养分期和开花期的午前均可；PL型的最佳采收期在养分期的晚上采收最好。因为本项目设定的养分期为植株没有长到终究高度的时期，且本论文各类型均只触及一个试验样品，因而有必要对更多的紫苏种质进行养分期至开花期的首要特征成分含量改变的研讨，以断定最佳的采收时刻，以及合适的采收期规模。
各化学型类别不受成长发育影响，标明遗传要素决议了化学型。PA和PK型的特征成分和首要成分相对含量都比较安稳，而PL型的特征成分随成长发育大起伏下降，倍半萜类成分和芳香类成分的相对含量在成长发育期出现较大改变，并且组成中还存在很多各类成分代谢的上游化合物，标明该化学型或许具有原始性和多变性。
一天之中，PA型特征成分紫苏醛相对含量各个时期基本上从早到晚逐步下降，D-柠檬烯相对含量早晨较黄昏高。PK型特征成分紫苏酮在养分期和开花期正午相对含量高于迟早样品，果熟期则相反。PL型特征成分紫苏烯相对含量在养分期和果熟期都是正午最高，开花期则是黄昏样品最高。
蒸腾油中组分的含量无论是随成长发育仍是一天的改变包含了组成、降解、转化和发出几个一起效果的进程，本研讨经过对3个紫苏单萜类化学型组成改变的开始研讨有助于找到一些特别的类型和改变阶段，为后续深化的组成生物学研讨奠定根底。
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