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蒋超　罗宇琴　袁媛　黄璐琦　金艳　赵玉洋

[摘要] 为树立一种能一起辨别人参、三七、西洋参及其掺杂品的办法。经过剖析人参属ITS，18S和matK序列，寻觅特异性SNP位点规划引物，树立多重位点特异性PCR法，并对不同来历的人参、三七、西洋参样品进行扩增，依据特异性条带巨细进行辨别。在退火温度为60 ℃，循环数为35时，人参、三七和西洋参别离呈现约250，500，1000 bp的特异性条带。该办法关于人参、三七、西洋参彼此掺杂的混合样品，人参中掺杂三七或西洋参以及三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5%，对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5%，掺杂三七的检出限为1%。标明树立的多重位点特异性PCR可用于人参、西洋参、三七的掺杂断定。

[关键词] 人参； 西洋参； 三七； 多重位点特异性PCR； 掺伪； 分子断定

Identification of Panax ginseng， P. notoginseng and P. quinquefolius

admixture by multiplex allelespecific polymerase chain reaction

JIANG Chao， LUO Yuqing， YUAN Yuan*， HUANG Luqi， JIN Yan， ZHAO Yuyang

（State Key Laboratory of Daodi Herbs Breeding base， National Resource Center for Chinese

Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] To achieve a molecular method to identify Panax ginseng， P. notoginseng，P. quinquefolius and their admixture. The ITS，18S and matK sequences of Panax genus were analyzed to develop speciesspecific SNP marker. Three pairs of speciesspecific primers were designed to establish a multiplex allelespecific polymerase chain reaction （MASPCR） and the samples from different regionwere tested. The results showed that when the annealing temperature was 60 ℃ and the cycle number was 35， approximately 250， 500，1 000 bp specific band were obtained from P. ginseng， P. notoginseng and P. quinquefolius obtain， respectively. This method could also be used to authentificate admixture samples and could detect 0.5% percent of P. notoginseng or P. quinquefolius adulterated in P. ginseng， or 0.5% percent of P. ginseng or P. quinquefolius adulterated in P. notoginseng. The detect limit of P. ginseng in P. quinquefolius was 0.5% and P. notoginseng in P. quinquefolius was 1%. This results showed that the present method could be used as a promise method to identify Panax ginseng， P. notoginseng， P. quinquefoliusand their admixture.

[Key words] Panax ginseng； Panax notoginseng； Panax quinquefolius； multiplex allelespecific polymerase chain reaction； admixture； molecular identification

人參、西洋参、三七是我国常用贵重中药，其根、根茎、叶、花、果实等均做药用，价值很高。在中医临床用药上，人参性温，成效大补元气、固脱生津、安神；三七性温，成效散瘀止血、消肿定痛；西洋参性凉，成效补气养阴、清热生津，三者药效具有很大差异，不能混用。但是，因为人参、三七、西洋参为人参属近缘物种，形状和化学成分类似，商场时有掺杂混用现象发作，人参、西洋参饮片或人参花、西洋参花、三七花彼此掺杂尤为常见，对用药安全形成危害，需求树立精确、牢靠、特别是能一起检测是否存在彼此掺杂的断定办法。

分子断定尤其是依据SNP的办法，因其具有精确性高、特异性好、不受环境影响等长处，在人参属物种断定中已有运用，如聚合酶链式反响单链构象多态性（PCRSSCP）[1]、聚合酶链式反响限制性内切酶酶切图谱多态性（PCRRFLP）[2]、位点特异性PCR或多重PCR[36]以及序列测定技能[6]等。但这些技能只重视人参属真伪品的断定，无法断定是否存在掺杂品，对商场实践存在的花、叶、饮片类掺杂样品需求进行屡次PCR反响才干断定。本研讨经过树立多重位点特异性PCR办法辨别人参、三七和西洋参，只经过1次PCR反响即可精确地对三者及其彼此掺伪进行辨别，并对反响条件进行优化，力求树立精确安稳的人参属掺杂样品检测办法。

1 资料与办法

1.1 植物

人参原植物（包括根和叶）采自东北不同产区以及北京市怀柔区，由我国农业科学院特产所许世权研讨员断定，三七原植物采自云南文山州不同产区，由昆明理工大学崔秀明教授断定，西洋参原植物采自河北、吉林和北京，竹节参、珠子参和羽叶三七原植物采自安徽、湖北和云南，由湖北轻工大学陈平教授断定。人参、西洋参、三七、竹节参、珠子参花、种子及药材样品采自亳州药材商场，由安徽中医药大学周建理教授和我国中医科学院中药资源中心金艳助理研讨员断定。一切样品经减压枯燥后保存于我国中医科学院中药资源中心，样品详细信息见表1。

1.2 辨别符号取得与引物规划

此前的研讨已发现人参和西洋参的特异性SNP位点[4]，本研讨参阅此位点运用Primer Premier 5.0规划出人参、西洋參的特异性辨别引物。为寻觅三七辨别位点，从NCBI数据库中下载人参属物种ITS，rbcL，matK，18S rRNA序列，运用BioEdit软件进行同源对齐，校正后剖析其特异性SNP位点，发现三七花ITS序列（以JQ764993.1为参照）第57，68，70，522位均存在特异性SNP位点，别离为T，T，G，T，而其他人参属一切物种包括人参均为C，C，A，A，以此为根底运用Primer Premier 5.0软件规划三七花特异性辨别引物，使正反向引物3′端位均于SNP位点上，调整退火温度在50～55 ℃，并剖析所规划的人参、西洋参、三七引物间发夹结构、引物二聚体或过错引发状况。规划的特异性辨别引物序列见表2，由生工生物工程（上海）有限公司组成。

1.3 DNA提取

取1 g植物资料，运用球磨破坏机破坏至能过5号筛。取粉末20 mg，运用碱裂解法[7]提取总DNA，运用Nanodrop 2000测定DNA浓度，调整浓度至30 mg·L-1，用于PCR扩增或于-20 ℃下保存。

1.4 PCR扩增及电泳

多重位点特异性PCR辨别反响在200 μL的PCR管中进行，25 μL PCR反响系统包括 10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs混合液（10 mmol·L-1）1.5 μL，人参上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，三七上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，西洋参上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.4 μL，DNA模板（10～50 ng） 1 μL，双蒸灭菌水 19.1 μL，反响液振动混匀，瞬时离心后置PCR仪上进行扩增。程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共35个循环；终究72 ℃再延伸3 min。PCR产品参加Loading buffer后经EB预染的1.2%的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像仪调查成果。

2 成果与剖析

2.1 多重位点特异性PCR条件的断定

2.1.1 退火温度与循环数 前期预试验成果发现运用对应的特异性辨别引物进行扩增，人参、三七、西洋参在58～62 ℃时别离能扩出约250，500，1 000 bp巨细的条带，以此为根底进行多重位点特异性PCR辨别，并对影响多重PCR特异性、精确性的关键因素退火温度和循环数进行调查。成果标明退火温度为60～62 ℃时人参、三七、西洋西洋参别离呈现约250，500，1 000 bp巨细的特异性条带，无非特异性扩增及假阳性条带呈现，但61 ℃以上时人参、三七特异性条带亮度显着下降，断定多重PCR退火温度为60 ℃，见图1A。对循环数进行调查，31～37个循环不时人参、西洋参、三七均能取得正确的辨别成果，35个循环及37个循环PCR条带亮度大于31，33个循环，见图1B。考虑到根、叶、花、种子DNA提取质量与浓度或许存在差异，药材经加工后DNA存在降解呈现假阴性成果的危险，挑选PCR循环数为35个循环，对新鲜植物资料的辨别，可削减循环数至31个。

2.1.2 最适引物量的断定 PCR引物用量及引物间的彼此份额对多重特异性PCR成果有重要影响。依据预试验成果，以西洋参、三七引物量均为0.2 μL为根底，别离调查人参上下游引物用量为0.1，0.2，0.3，0.4 μL时对多重特异性辨别成果的影响，成果0.1 μL时人参无条带，0.3，0.4 μL时人参条带显着，且无假阳性条带呈现，断定人参上下游引物量为0.3 μL；在此根底上调查三七用量别离为 0.1，0.2，0.3，0.4 μL的影响，成果 0.1 μL 时三七条带昏暗，0.2 μL引物时三七电泳条带亮度大且无假阳性条带呈现。在此根底上同法西洋参用量为0.15，0.2，0.25，0.3 μL，成果0.25 μL引物时条带亮度大，终究断定引物配比为人参引物量三七引物量西洋参引物量0.3 μL∶0.2 μL∶0.25 μL。

2.1.3 Taq酶与PCR仪 运用建好的办法在不同的Taq酶和不同PCR仪上进行多重位点特异性PCR以调查办法的适用性。成果标明，运用低保真的rTaq（Takara公司）、Fast Taq聚合酶（TransGen公司）、中度保真的Ex Taq（Takara公司）酶均取得正确的辨别成果，而高保真性的的PrimeSTAR HS Taq进行断守时人参、三七、西洋参样品均呈现假阳性条带，见图1C。这或许是因为高保真Taq DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，导致坐落3′端的辨别位点被酶切，剩余序列彻底匹配取得扩增导致的，表现出与惯例位点特异性PCR共同的特性[8]。运用不同的PCR仪，除旧式的PCT100型PCR仪外，其他PCR仪均取得正确的辨别成果，见图1D，因为多重PCR对退火温度灵敏，不同PCR仪温控水平有差异，在进行断守时应进行温度调校。

2.2 精确性调查

运用建好的办法对来自全国主产区的140批人参、79批三七、44批西洋参及40批人参属其他物种样品进行多重位点特异性PCR扩增，成果人参原植物、药材、花、种子等均扩增取得250 bp的特异性条带，三七原植物、药材、三七花均取得约500 bp的特异性条带，西洋参取得约1 000 bp的特异性条带，人参属其他物种包括竹节参、珠子参、羽叶三七均无条带，无假阳性和假阴性成果呈现。部分成果见图2。

2.3 掺伪检出限

为检测多重位点特异性PCR对掺伪样品辨别能力。取西洋参和三七粉末各0.5g等量混匀，取不同量混合物与人参粉末充沛混匀，取得人参粉末中掺有50%，20%，10%，5%，2%，1%西洋参三七混合物的系列混合粉末，运用上述办法提取DNA并进行多重特异性PCR断定，以检测办法对人参中掺杂西洋参、三七的检出限；以相同的办法制造人参、西洋参混合物和三七、西洋参混合物，并制造相应系列混合粉末，以检测三七中掺杂西洋参、人参的检出限和西洋参中掺杂人参、三七的检出限。

成果标明人参中掺杂0.5%以上的三七或西洋参可检出见图3（泳道7），同理其对西洋参三七中掺杂西洋参或人参的检出限均为0.5%（泳道15），对西洋参中掺杂人参的检出限为0.5%（泳道23），掺杂三七的检出限为1%（泳道22）。

4 评论

真伪掺杂品的辨别一直是中药辨别的难点问题，依赖于具有一起检测真伪品特异性符号的办法的开发。多重PCR是一种在同一系统内进行多个PCR扩增的技能，其杰出优势是在一次检测中一起表征多个位点或基因片段，然后具有掺杂检测的潜力。此前的人参属多重PCR辨别办法往往只重视于能否一起检测人参、西洋参、三七物种，对每种药材均需求2对引物的扩增成果才干断定，无法用于断定是否存在掺杂样品。如刘丽等[3]的多重PCR辨别系统成果的断定，只存在150 bp条带的为人参、只存在400 bp条带为三七，一起存在150，400 bp条带为西洋参，其成果无法区别西洋参加人参三七混合样品，也无法区别西洋参加人参西洋参混合样品。鉴于此，本文针对人参、西洋参、三七别离规划了位点特异性辨别引物，对每种药材运用单一引物对进行辨别，然后能检测掺杂样品，做到对中药真伪的精确操控。

人参、西洋参、三七为近缘物种，遗传物质类似，DNA序列一般只存在少量的SNP位点，专特点符号开发困难。本研讨经过对人参属一切物种的18S，ITS，matK序列进行剖析，别离发现3组SNP位点，可特异性辨别人参、西洋参、三七。因为只存在单核苷酸的变异，引物间彼此作用、PCR反响系统、循环参数等均直接影响特异性PCR辨别的精确性和特异性[910]。本研讨对影响PCR特异性的关键因素退火温度、循环数、Taq酶品种和引物用量进行了调查，发现本研讨树立的办法对条件要求较为宽松，但Taq酶品种对其特异性具有较明显的影响，仅不具有3′5′外切酶活性的Taq酶能精确辨别人参、西洋参、三七。为调查多重位点特异性PCR办法的精确性，本研讨对合计超越300 批人参、西洋参、三七及其他近缘物种进行了试验验证，包括根、叶、花、种子和不同类型的药材，成果一切人参、三七、西洋参均取得正确的阳性辨别成果，其他人参属近缘物种均为阴性，与形状学断定成果彻底符合，进一步验证了该办法的牢靠性和安稳性。为检测该办法对混伪品的辨别能力，本研讨制造了一系列不同掺伪程度的人参、西洋参、三七混合样品并进行多重位点特异性PCR扩增，成果对人参、西洋参、三七中恣意两者彼此掺伪的检出限均到达1%，可满意中药产业链尤其是不同形状产品的出产查验的需求。传统对人参和三七经过性状进行辨别，对人参粉和三七粉依据草酸钙簇晶的明显差异进行显微辨别，对种子种苗、果实、茎叶、花等其他药用部位则需求别的树立专用的辨别办法，依据DNA的多重PCR辨别办法可一起对人参、三七、西洋参的不同成长部位、发育阶段与加工方式的产品进行掺杂辨别，是对传统辨别办法的弥补和立异。

[参阅文献]

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[责任编辑 吕冬梅]