药效学目标 根据药效学和目标成分优选鼻鼽颗粒醇沉工艺
张艳军+刘莉莉+吴云+胡军华+常秀娟+萧伟+晁恩祥
[摘要] 经过调查对血清组胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α的影響，点评鼻鼽颗粒醇沉工艺的合理性。以咖啡酸和迷迭香酸的含量为归纳目标，选用Plackett-Burman规划挑选影响鼻鼽颗粒水提组醇沉工艺的明显性影响要素；在此根底上，经过Box-Behenken规划对明显性要素进一步优化，断定最佳醇沉工艺。断定鼻鼽颗粒水提组的最佳醇沉工艺条件为：浓缩液相对密度1.15（65 ℃）、醇浓度70%、停止时刻12 h。药效学点评结合Plackett-Burman和Box-Behnken规划试验优化断定的醇沉工艺安稳可行，猜测性好，为鼻鼽颗粒的产业化出产供给了牢靠依据。
[关键词] 鼻鼽颗粒；药效学；Plackett-Burman规划；Box-Behnken规划；醇沉工艺
[Abstract] To evaluate the rationality of alcohol precipitation technology of Biqiu granule by investigating its effect on serum histamine，IgE，IL-4，IFN and TNF-α. The contents of cafferic acid and rosmarinic acid were used as the evaluation indexes，and some factors affecting index were firstly evaluated by Plackett-Burman design；then alcohol precipitation technology was further optimized by Box-Behnken design to determine the optimal alcohol precipitation conditions. The best alcohol precipitation conditions were as follows： the relative density of herb liquor was 1.15 （65 ℃）；the concentration of alcohol was 70%，and standing time was 12 hours. Optimal alcohol precipitation technology of Biqiu granules determined by pharmacodynamic screening，Plackett-Burman and Box-Behnken design tests，was stable and feasible with good predictability，providing reliable basis for the industrialization production of Biqiu granules.
[Key words] Biuqiu granules；pharmacodynamics；Plackett-Burman design；Box-Behnken design；alcohol precipitation process
doi：10.4268/cjcmm20162418
鼻鼽颗粒是由国医大师晁恩祥教授集多年临床经验精心研发的药物，由辛夷、紫苏叶、荆芥、苍耳子、白芷等9味中药材组成，具有分散风邪，通利鼻窍，引导肺气，舒缓鼻窍等成效，用于医治某些致敏要素引起的过敏性鼻炎（常见症状如鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕等）。中药醇沉处理是制剂进程中常用的纯化办法，具有工艺老练、进程清晰、对设备要求不高级长处，并且能够削减服用剂量、获得杰出的成型性[1-2]。本文选用药效学目标对醇沉工艺的合理性进行了点评，以咖啡酸和迷迭香酸含量的归纳评分为目标，经过Placket-burman规划[3]对影响鼻鼽颗粒水提醇沉工艺的几个要素进行了挑选，并进一步使用Box-Behnken[4-5]对挑选出的3个主要要素浓缩液相对密度、醇浓度、停止时刻进行二次多项式拟合[6-7]，树立了相关猜测模型，依据回归模型断定最优工艺参数，为鼻鼽颗粒的出产工艺规范和后续的研讨奠定了根底，为中药醇沉工艺的合理性供给试验依据。
1 资料
D2015W 型电动拌和器（上海梅颖浦仪器仪表制作有限公司）；Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Sartorious BP211电子天平（美国赛多利斯公司）；密度计（北京华科电子仪器开发中心）。
鼻鼽颗粒醇沉前浓缩液（江苏康缘药业股份有限公司，批号20141003）；工艺一（江苏康缘药业股份有限公司，醇沉样品，批号20141201）；工艺二（江苏康缘药业股份有限公司，未醇沉样品，批号20141202）；迷迭香酸对照品，购自我国食物药品检定研讨院（批号111871-201102，供含量测定用）；咖啡酸对照品，购自我国食物药品检定研讨院（批号110885-200102，供含量测定用）；卵白蛋白OVA，购自sigma（货号A5503）；氢氧化铝Al（OH）3，购自sigma（货号239186）；鼻炎康片（购自佛山德众药业有限公司，批号12170）；IgE免疫放射剖析测定盒，购自北京华英生物技能研讨所（批号20141101）；IL-4，TNF-α，IFN放免试剂盒，购自北京华英生物技能研讨所（批号20141120）；95%乙醇；药用规范提取工艺用水为纯化水；液相用乙腈为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为市售剖析纯。
SD大鼠，雄性，体重180～220 g，购自上海西普尔-必凯试验动物有限公司，许可证号SCXK（沪）2013-0016，SPF级。动物养殖于规范条件下，12 h明暗替换，（22±2）℃，自在摄食饮水。动物在上述环境中适应性养殖1周后开端试验。
2 办法与成果
2.1 样品制备
取鼻鼽颗粒醇沉前液100 g于洁净烧杯中，在拌和下向药液中匀速参加95%乙醇，乙醇加完后将烧杯封口，室温下静置必定时刻，取上清液，即得鼻鼽颗粒醇沉液。
2.2 咖啡酸和迷迭香酸含量测定
2.2.1 色谱条件
Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液为活动相A，以乙腈为活动相B，梯度洗脱（0～50 min，91%～34% A），检测波长327 nm，流速1.0 mL·min-1，进样体积10 μL，柱温为30 ℃。理论板数按迷迭香酸峰核算均应不低于5 000。对照品与样品色谱图见图1。
2.2.2 对照品溶液的制备
取咖啡酸、迷迭香酸对照品适量，精细称定，加甲醇溶解并稀释成每1 mL中含咖啡酸、迷迭香酸别离为4，15 μg的溶液，摇匀，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备
称取适量醇沉上清液，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 线性关系调查
称取咖啡酸、迷迭香酸对照品适量，加甲醇溶解并定容，摇匀，得浓度别离为22.12，116.92 mg·L-1的混合对照品储藏液，别离精细汲取混合对照品储藏液适量，以甲醇倍倍稀释，摇匀，即得。别离进样10 μL，按2.4.1色谱条件进行剖析，以进样浓度的对数为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），制作规范曲线。
2.2.5 精细度试验
别离精细汲取咖啡酸、迷迭香酸的对照品溶液10 μL，按2.4.1色谱条件，进样，测定，接连6次，测得咖啡酸和迷迭香酸的峰面积的RSD为0.60%，0.90%，成果标明，精细度杰出。
2.2.6 安稳性试验
精细汲取2.1.3项供试品溶液，按2.2.1项色谱条件，别离于制备后0，2，6，4，8，10，12，24 h别离进样测定，以咖啡酸和迷迭香酸的峰面积核算，成果RSD为0.50%，1.0%，成果标明供试品溶液放置24 h安稳。
2.3 药效挑选
2.3.1 办法
2.3.1.1 大鼠过敏性鼻炎模型树立 选用现在国内常用的“卵蛋白打针及其鼻粘膜刺激法”，具体办法：选清洁级SD大鼠，以卵白蛋白（OAV）10 mg，Al（OH）330 mg及生理鹽水l mL混合后腹腔打针，隔日1次，接连7次，进行初度免疫；第15天进行加强免疫，每侧鼻孔给予4% OVA 20 μg（50 μL）滴鼻，隔日1次，接连7次。正常组给与等量生理盐水[8]。
过敏性鼻炎动物模型成功规范：于末次滴鼻致敏后调查30 min大鼠搔鼻、喷嚏、鼻溢等行为，以上各项目标均选用叠加量化记分法，总分>5分标明造模成功，之后持续隔天滴鼻保持直至医治试验完毕。
记分办法：①鼻痒：抓挠3 次为1 分，3～10 次2 分，抓挠不止3 分；②喷嚏：1～3个为1分，3～5 个2 分，接连喷嚏3 分；③清涕：流至鼻孔为1分，超出前鼻孔为2分，涕流满面为3分。
2.3.1.2 分组及给药 60只大鼠随机分红5组，每组12只。别离空白对照组，模型对照组，鼻炎康对照组0.4 g·kg-1，工艺一、工艺二 2.0 g·kg-1。除空白组外，其他各组动物于致敏第15日开端给药，每日1次，接连14 d[8]。
2.3.2 目标检测
2.3.2.1 过敏性鼻炎SD大鼠行为学调查 在OVA 滴鼻30 min 内调查鼻炎症状，记载挠鼻、喷嚏次数及清涕呈现的轻重程度，每日调查1次。用积分迭加法评分（挠鼻：抓挠3次为1分，3～10次2分，抓挠不止3分；喷嚏：1～3个为1分，3～5个2分，接连喷嚏3分；清涕：流到鼻前孔1分，超越鼻前孔2分，涕流满面3分）。
2.3.2.2 血清组胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α检测 末次给药30 min后，水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，别离血清，-70 ℃保存，依据试剂盒阐明办法进行IgE，IL-4及TNF-α测定。
2.3.2.3 计算学处理 一切数据以±s标明，组间比较选用单要素方差剖析，计算软件SPSS 17.0。
2.3.3 成果
2.3.3.1 SD大鼠行为学改动状况 模型大鼠呈现典型的过敏性鼻炎的症状（频频的抓鼻、打喷嚏和流鼻涕等），经过阳性对照组、工艺一及工艺二接连给药后的评分红果见表1。与模型组比较，阳性对照组、工艺一及工艺二均能够下降抓鼻、打喷嚏和流鼻涕的频率，其间工艺一差异具有十分明显的含义（P<0.001）。与阳性对照组及工艺二比较，工艺一的评分差异具有计算学含义（P<0.05）。
2.3.3.2 对血清组胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α的影响 与空白组比较，模型组血清IgE，组胺，IFN及TNF-α处于较高水平，差异具有明显含义（P<0.01），见表2。与模型组比较，鼻鼽颗粒不同工艺血清细胞因子水平均有下降趋势，工艺一可下降IgE和IFN，差异有计算学含义（P<0.05，P<0.01），工艺二可下降TNF-α，差异有计算学含义（P<0.05）。归纳点评，鼻鼽颗粒医治过敏性鼻炎下降免疫因子水平方面效果清晰，相对于醇沉前样品（工艺二），醇沉样品（工艺一） 可明显下降血清组胺，IgE，IFN及TNF-α水平，效果较好。
2.4 试验规划
2.4.1 Plackett-Burman试验规划
Plackett-Burman 试验对每个要素取3个水平（-1，1），在预试验的根底上，选取影响较大的6个要素：拌和速度（A，400，600 r·min-1）、加醇速度（B，3.0，5.0 mL·s-1）、静置温度（C，20，40 ℃）、静置时刻（D，10，14 h）、浓缩液相对密度（E，1.05，
1.20）、醇浓度（F，60%，80%），进行试验。Plackett-Burman 规划主动生成12次试验，每组试验重复3次以上，以3次试验咖啡酸和迷迭香酸含量的归纳评分（归纳评分=咖啡酸/最大含量×50+迷迭香酸/最大含量×50）为调查目标，试验规划及成果见表3，各要素对调查目标影响的次第见图2。
由帕拉图 2 可知，要素静置时刻、浓缩液相对密度、醇浓度影响比较明显，可作为下一步试验优化的要素。要素A，B，C效应不明显，对试验成果影响较弱，鄙人一步研讨中别离设定拌和速度500 r·min-1、加醇速度4.0 mL·s-1、静置温度30 ℃。
2.4.2 Box-Behnken 试验规划
依据Plackett-Burman筛序成果，以咖啡酸和迷迭香酸含量的归纳评分为调查目标，选取浓缩液相对密度（A）、醇浓度（B）、静置时刻（C）3个要素为自变量，每个自变量的低、中、高试验水平别离以-1，0，1进行编码。每个试验重复3次，取平均值，Box-Behnken试验规划及成果见表4。
2.4.3 Box-Behnken 试验成果剖析
使用Design-Expert8.0软件对表4中数据进行二次回归拟合，得出回归拟合方程：R归纳评分=94.46+4.05A-2.05B+1.66C-1.85AB-5.87AC-1.14BC-13.24A2-6.62B2-2.05C2，规范差1.49，R2=0.990 1。对模型进行方差剖析，成果见表5。标明模型P<0.001，呼应面模型到达明显水平，影响醇沉工艺要素的主次次序为A>B>C，其间要素A（浓缩液相对密度）影响比较明显（P<0.001），交互效果中AC的影响比较明显（P<0.001），失拟项（P>0.05）不明显，标明二次方程猜测值与实践值吻合度较高。各方程对应的三维呼应面图、等高线见图3。
2.4.4 验证试验
使用Design-Expert 8.0.6软件对影响鼻鼽颗粒水提组醇沉工艺的明显性影响要素归纳剖析，得到醇沉的最佳工艺：浓缩液相对密度1.13、醇浓度68.04%、静置时刻12.65 h、归纳评分为95.50。考虑到出产实践状况，故将工藝参数设定为：浓缩液相对密度1.15、醇浓度70%、静置时刻12 h，以该工艺参数进行3次验证试验，取其平均值，归纳评分为93.85，底子与模型猜测值共同，阐明模型优化成果可信，断定的最优工艺合适出产要求。
3 评论
紫苏叶、荆芥别离为方中的君药和臣药，在临床上使用比较广泛，可用于医治呼吸道疾病如变应性喉炎、鼻炎、呼吸道过敏等[9-12]，其间都含有酚酸类成分咖啡酸、迷迭香酸[13]。迷迭香酸具有抗过敏、抗氧化和免疫抑制等多种活性[12，14]，ToshiakiMakino等证明迷迭香酸具有抗过敏效果，并且在体内有必定的医治效果[15]。李林等研讨发现迷迭香酸对大鼠抗Thyl.1系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）具有医治效果及能下调肾安排中转化生长因子β1（TGF-β1）的表达，然后起到医治炎症的效果[15-16]。咖啡酸亦具有抗炎、抗菌、抗病毒、升高白细胞及血小板等多种药理效果，杨九凌等[17]、王琦等[18]经过检索国内外文献，对咖啡酸的抗氧化、抗炎、镇痛、免疫调节等多种药理效果进行了报导。故本文挑选咖啡酸和迷迭香酸作为工艺优选的点评目标。此外，苍耳子中的绿原酸在抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒等有必定的效果[19-20]。
Plackett-Burman规划是一种2水平的试验规划办法，它试图用最少试验次数挑选并断定对成果影响比较明显的要素，防止在后期的优化试验中因为部分因子不明显而糟蹋试验资源，现已被广泛使用于化学、质量操控和食物科学等范畴[5]。Box-Behnken呼应面剖析法克服了现在正交试验只能给出最佳要素水平组合的缺陷，不仅仅能够经过相关数据进行拟合，挑选出全体要素中的最佳工艺组合和呼应值，并且能够在要素和呼应值之间树立模型，对试验的猜测性较好，信息量大，精度度高，在未来中药范畴的研讨中会越来越广泛[6-7]。
因为中药复方成分杂乱，在中间体精制进程中，选用切实可行的归纳点评办法，能够更好的发挥醇沉工艺的有用性和科学性[21]。本文先经过药效点评法断定醇沉工艺的合理性，在不影响药效的前提下，使用Placket-Burman规划和Box-Behnken规划相结合，以咖啡酸和迷迭香酸含量的归纳评分为目标，对鼻鼽颗粒醇沉工艺进行了优化，并树立了相关数学模型，具有较好的猜测性。验证试验标明，该工艺安稳可行，醇沉精制后，除去了药材中的杂质，削减了给药剂量，提高了药物的安稳性，为后续的鼻鼽颗粒制剂研讨奠定了根底，一起为中药浸膏的醇沉工艺研讨供给了必定的理论指导。
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[责任编辑 孔晶晶]