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刘冠兰?付济宁?张龙?刘英
【摘要】 意图 调查CD8+ T细胞对胃癌细胞增殖及其外表受体雌激素受体α（ERα）的影响。办法 使用健康成人外周血别离得到的CD8+ T细胞与胃腺癌细胞系SGC-7901混合培育。混合培育96 h后用经流式细胞仪查看细胞周期；免疫荧光法检测剖析共培育48 h后SGC-7901细胞的凋亡状况及雌激素受体表达状况。成果 经流式细胞仪查看， 混合培育96 h后CD8+ T细胞与SGC-7901细胞粘附， 大部分SGC-7901细胞滞留在G1期；混合培育组与对照组比较， SGC-7901细胞膜上表达ERα数显着下降。定论 CD8+ T细胞按捺胃癌细胞增殖的一起下降ERα的表达， 为深入研讨胃癌的生物医治及靶向医治奠定了根底。
【关键词】 CD8+ T细胞；胃癌；SGC-7901细胞；雌激素受体
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.08.019
胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一， 全球超越 40%的胃癌病例发作在我国， 死亡率在恶性肿瘤中占第二位[1]。现在对胃癌的医治主要是采用以手术为主的归纳医治， 但整体效果不令人满意。因为肿瘤患者机体免疫功用低下或缺点与恶性肿瘤发作开展的各阶段联系密切， 而病况开展又进一步加剧免疫低下状况， 恶性肿瘤的免疫医治已成为现在的研讨热门。
CD8+ T 细胞又称作 T 按捺细胞或细胞毒 T 细胞， 能够特异性辨认细胞外表的MHCI 类抗原然后特异性杀死肿瘤细胞， 在抗肿瘤免疫中起到了重要效果。但其效果的相关机制还不清楚。在本研讨中， 使用健康成人外周血别离得到的CD8+ T细胞与胃腺癌细胞系SGC-7901共培育， 经过免疫荧光法检测剖析共培育48 h后SGC-7901细胞的凋亡状况及雌激素受体表达水平， 以期为临床挑选个体化医治计划供给理论依据， 前瞻性辅导肿瘤患者的免疫医治， 详细陈述如下。
1 资料与办法
1. 1 外周血单个核细胞别离 将10 ml全血（健康志愿者）转入50 ml离心管中， 参加10 ml PBS溶液稀释， 悄悄混匀；取两支15 ml离心管， 先参加5 ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液悄悄加到两支离心管的Ficoll上层， 每只离心管各10 ml稀释血液；2000 r/min， 30 min；用1 ml枪头插到白色云五层， 汲取单个核细胞（PBMC）置另一洁净的15 ml离心管中。参加PBS至10～15 ml， 1500 r/min， 10 min离心后去掉上清， 再参加培育基（RPMI 1640+10% FBS）进行相同操作的清洗2次。
1. 2 外周血单个核细胞培育 别离得到的PBMC用RPMI 1640+10% FBS+异戊烯焦磷酸（IPP） 1 μg/ml+白细胞介素-2 （IL-2） 20万U/ml培育， 2～3 d换培育基一次， 第五代（P5）用于试验。
1. 3 流式细胞仪查看T细胞表型 取100 μl细胞与PBS+2%胎牛血清（FBS）混悬液， 别离参加10 μl CD3、CD4、CD8抗体（贝克曼公司）， 震动器充沛混匀后， 室温避光放置10 min；裂解红细胞：混合液放置10 min后， 参加红细胞裂解液500 μl （贝克曼公司）， 均匀混合后， 室温避光放置10 min；离心（2000 r/min， 5 min）后倒掉上清， 上机检测：参加500 μl的缓冲液， 混匀后上流式细胞仪器检测（仪器为贝克曼公司FC500型流式细胞仪）。
1. 4 CD8+ T别离 取5个小平皿（60 mm）， 参加10%多聚赖氨酸0.5 ml， 37℃5%CO2培育箱中过夜。4℃参加CD8抗体2 μl 4 h。参加上述单个核细胞混悬液过夜。次晨， 去上清。0.25%胰酶消化贴壁的细胞。细胞计数板计数后， 取10000个细胞进行流式细胞仪检测， 办法同上。
1. 5 CD8+ T与SGC-7901细胞共培育 SGC-7901细胞计数后， 均匀铺到5个小平皿（60 mm）中， 过夜培育让细胞贴壁， 交融率到70%～80%。取两小平皿用胰酶消化， 计数后别离按CD8+ T与SGC-7901细胞1∶10参加成为贴壁肿瘤细胞+T细胞培育组；独自SGC-7901细胞和独自T细胞为对照组。SGC-7901细胞与CD8+ T细胞共培育48 h后显微镜调查细胞增殖状况；吸去旧培育基按相同份额换含新CD8+ T细胞的新鲜培育基持续培育48 h。培育96 h后， 吸去培育基， 进行细胞周期检测和免疫荧光查看。
1. 6 细胞周期检测 CD8+ T与SGC-7901细胞混合培育在96 h后， 0.25%胰酶消化。消化后的细胞经PBS 清洗2次， 参加FITC符号annexin Ⅴ和PI溶液， 悄悄混均。室温避光放置15 min， 用流式细胞仪查看DNA含量。所得成果用细胞周期剖析软件（Cell FIT， Becton Dickinson）剖析。
1. 7 免疫荧光查看 将CD8+ T用DAPI染核后与SGC-7901细胞共接种到预先放置有处理过的盖玻片的培育皿中， 96 h后取出盖玻片， PBS洗2次。4%多聚甲醛4℃固定细胞过夜。3%小牛血清白蛋白（BSA）关闭30 min， 参加ERα抗体（PE符号） 4℃过夜。PBST漂洗3次， 冲刷5 min/次。参加二抗室温避光孵育1 h， PBST漂洗3次， 冲刷5 min/次后， 再用蒸馏水漂洗1次。滴加封片剂一滴， 封片， 荧光显微镜查看。
2 成果
2. 1 CD8+ T细胞检测 经流式细胞仪查看， 培育得到的CD8+ T阳性率为91.3%。
2. 2 混合培育96 h后细胞周期查看 经流式细胞仪查看， 混合培育96 h后大部分细胞滞留在G1期。
2. 3 混合培育96 h后SGC-7901细胞ERα抗体表达状况 CD8+ T细胞用DAPI将细胞核染成蓝色， ERα在荧光显微镜下呈绿色， 在SGC-7901细胞膜上表达。混合培育96 h后， 可见CD8+ T细胞与SGC-7901细胞粘附。混合培育组与对照组比较， SGC-7901细胞膜上表达ERα数显着下降。见图1。
图1 混合培育96 h后SGC-7901细胞ERα抗体表达状况
注：A图， CD8+ T组96 h贴壁增殖状况；B图， SGC-7901细胞96 h ERα抗体表达；C图， 混合培育96 h后SGC-7901细胞ERα抗体表达状况
3 评论
现代肿瘤免疫生物学的飞跃开展， 使恶性肿瘤的免疫医治成为现在的研讨热门， 它将成为继手术、化疗、放疗之后的第四种肿瘤医治形式。本研讨经过CD8+ T细胞与SGC-7901细胞混合培育， 证明CD8+ T细胞对SGC-7901细胞的增殖具有显着按捺效果；并下降SGC-7901细胞的特异性受体ERα的表达。因而， 本研讨成果为肿瘤的生物靶向医治供给了理论依据。
雌激素调理成长、分解和功用多样化的方针安排表里的生殖体系[2]。雌激素的生物功用大部分是对经过靶细胞的雌激素受体ERα和ERβ， 调理相关基因的表达。虽然胃不是称为性激素的直接方针器官， 流行病学和动物研讨标明胃癌或许对雌激素灵敏。胃癌的男女发病比率约为2∶1。因而， 有研讨以为雌激素或许对胃癌有维护效果。ERα和ERβ均在胃癌表达[3， 4]。ERα在胃癌发作、开展中的效果研讨较多， 大多以为胃癌中ERα的表达较ERβ多， 表达规模广泛， 且与胃癌的分解及搬运相关[5， 6]。部分ER阳性的胃癌患者彻底治愈切除后对内排泄医治反响杰出均阐明胃癌的ER与乳腺癌中的ER 相同具有代谢活性。因而， 对雌激素及其受体的相关研讨或许影响胃癌的发展和医治。迄今为止， 有关胃癌ER与预后的联系没有清楚。
CD8+ T 细胞又称作T按捺细胞或细胞毒T细胞， 经过穿孔素/颗粒酶途径和Fas/FasL途径能够高效、特异性地杀伤靶细胞， 而不危害正常安排。细胞毒性CD8 T细胞高表达的胃癌一般预后好于低表达的胃癌患者， 标明过继免疫在肿瘤免疫监视体系的关键效果[7]。本研讨成果还显现 CD8+ T细胞按捺胃癌细胞增殖。CD8+ T具有特异性直接杀伤肿瘤细胞的效果， 分解越差的肿瘤往往恶性程度越高， 越简单发生免疫耐受， 导致CD8+ T细胞表达下降。本研讨调查CD8+ T细胞对胃腺癌细胞ERα的表达， 成果显现， CD8+ T能够下降胃腺癌细胞ERα的表达。
综上所述， CD8+ T细胞按捺胃癌细胞增殖的一起下降ERα的表达， 为深入研讨胃癌细胞的生物医治及靶向医治奠定了根底。
参考文献
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[收稿日期：2015-11-09]