广谱抗菌真菌 广藿香内生真菌类群剖析及其抗菌活性研讨
王营+李浩华+谭国慧+李赛妮+严懂事+章卫民
[摘要] 从广藿香的根、茎、叶中共别离得到72株内生真菌，依据ITS序列剖析判定为25属40个种，其间拟茎点霉属Phomopsis、刺盘孢属Colletotrichum、镰刀菌属Fusarium为优势种群；广藿香内生真菌的散布存在显着的安排特异性，以茎中内生真菌的散布最多，占别离菌株总数的78%；活性测验成果显现共有15个属34株内生真菌至少对1种供试菌具有抗菌活性。成果标明广藿香内生真菌多样性丰厚，部分菌株具有显着的抑菌活性，值得进一步深入研讨。
[关键词] 内生真菌； 多样性； 广藿香； 抗菌活性
[Abstract] Seventy-two strains of endophytic fungi were isolated from roots， stems and leaves of Pogostemon cablin and identified as 40 species of 25 genera based on ITS sequences analysis. Among them， Phomopsis， Colletotrichum and Fusarium were dominant genera. Distribution of endophytic fungi in P. cablin showed obvious tissue-specificity， and more strains were isolated from stems with an isolation rate of 78%. The bioassay results indicated that 34 strains of 15 genera displayed antimicrobial activities against at least one of test bacteria or plant pathogenic fungi. The results obtained in this study showed that endophytic fungi in P. cablin were rich in species diversity， and some strains exhibited strong antimicrobial activities， which deserve further research.
[Key words] endophytic fungi； diversity； Pogostemon cablin； antimicrobial activity
植物内生真菌是指成长在植物体的根、茎、叶及果实等安排和器官内的一类真菌，是植物微生态系统中的重要组成成分，在进化过程中与宿主植物构成了互利共生的联系[1]。内生真菌不光能发生结构丰厚多样的次生代谢产品，已从中别离出多种生物活性物质，包含抗菌、抗肿瘤、抗氧化等天然化合物[2-3]，并且对植物的成长发育、活性成分的积累及植物抗逆性具有重要影响[4]。药用植物中相同存在着很多的内生真菌[5]，中药成分的构成、栽培、抗病性及道地性或许都与内生菌有亲近的联系[6]，因而，研讨药用植物内生真菌资源的多样性不只能够丰厚真菌资源宝库，并且关于中药资源的维护和可继续使用具有重要的含义。
广藿香Pogostemon cablin （Blanco） Benth.为唇形科Lamiaceae刺蕊草属Pogostemon Desf.植物，是十大广药之一，其入药最早记载于唐代《新修本草》和《千金翼方》中，自宋、金、元以来已广泛使用于临床。它具有芳香化浊、和间断呕以及发表解暑的功用，用于胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛的医治[7]。现代药理学研讨标明，广藿香具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、杀虫等作用[8-11]。现在，对广藿香内生真菌的研讨鲜有报导，为了评论广藿香内生真菌的多样性、群落组成及其散布特征，本研讨对其内生真菌进行了系统的别离和判定，并对别离得到的菌株发酵粗提物进行抗菌活性研讨，旨在挑选出具有杰出抗菌活性的菌株，为广藿香内生真菌的资源维护和开发使用供给根底资料和科学依据。
1 资料
1.1 仪器与试剂 RE-2000型旋转蒸腾仪，上海亚荣生化仪器厂；超净工作台，上海恒益科技有限公司；YXQ-WY21-600电热高压蒸汽灭菌锅，广州市华南医疗器械有限公司；THZ-C-1摇床，广州市正一科技有限公司；Mastercycler gradient5331 PCR仪，Eppendof公司；EPS 3501电泳仪，Amersham Pharmacia Biotech公司。氨苄青霉素、硫酸卡那霉素、二甲基亚砜（DMSO），均购自Sigma公司；Taq酶、DNA提取试剂盒，均购自大连宝生物工程有限公司；乙酸乙酯，广州化学试剂厂。
1.2 植物与内生真菌 广藿香植物于2012年10月采自广东阳春市马水镇，由广东药科大学中药学院酷寒静副教授判定为P. cablin。内生真菌别离自健康的广藿香根、茎、叶。植物标本和别离菌株保存于广东省微生物研讨所。
1.3 供试指示菌 细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、大肠杆菌（Escherichia coli，EC）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）。植物病原真菌：胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides，CG）、荔枝霜疫霉（Peronophthora litchic，PL）、鏈格孢（Alternaria alternata，AA）、柱枝双孢霉（Cylindrocladium scoparium，CS）、新月弯孢霉（Curvularia lunata，CL）。一切菌株均保存于广东省微生物研讨所。
1.4 培育基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培育基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，Vit B1 10 mg，琼脂20 g，蒸馏水1 L；察氏琼脂（CDA）培育基：NaNO3 3 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O4 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 0.01 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g；养分琼脂培育基：蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L。
2 办法
2.1 内生真菌的别离 取新鲜的广藿香根、茎、叶，用自来水冲刷洁净，置于滤纸上天然晒干，放入0.1%的升汞溶液中浸泡5～7 min后用无菌水漂洗4次，再放入75%的乙醇溶液中浸泡3～5 min后用无菌水漂洗3次。叶片用无菌剪刀剪去边际后，剪成约0.5 cm×0.5 cm的方块；根和茎用剪刀剪掉头尾部分，将中心部位剪成约1 cm长的小段。将上述安排块别离置于PDA和CDA培育基（含20 mg·L-1硫酸卡那霉素和20 mg·L-1氨苄青霉素）中，一起将上述经外表灭菌后不做任何处理的资料直接接种于对应培育基中作消毒作用检测，26 ℃恒温培育3～7 d后挑取形状不同菌落转接到新鲜培育基上，纯化后转接至斜面培育基中，4 ℃冰箱保存备用。
2.2 菌株的分子判定 将别离所得的内生真菌按惯例办法用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，作为PCR扩增的模板。PCR扩增选用真菌rDNA内转录距离区（rDNA ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向）扩增别离菌株的rDNA ITS区。PCR选用20 μL 反响系统，经过Ex Taq（TaKa-Ra）进行。反响条件：93 ℃预变性3 min；93 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；最终72 ℃延伸10 min。PCR产品由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。取得的序列经过BLAST程序在GenBank进步行类似性序列检索剖析，对别离菌株进行判定。
2.3 内生真菌的液体培育及粗提物制备 挑取经活化的内生真菌菌丝体接种于PD液体培育基中，28 ℃，120 r·min-1摇床培育7 d，过滤，搜集发酵液并用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于旋转蒸腾仪浓缩至干，得提取物浸膏。将提取物浸膏用DMSO溶解配制成50 g·L-1，备用。
2.4 抗细菌活性测定 将各供试细菌接种于养分琼脂液体培育基中，37 ℃培育24 h，用无菌生理盐水稀释，配制成1×105～1×107 CFU·mL-1的菌液。汲取1 mL菌液于灭菌的培育皿中，倒入已冷却到适宜温度的养分琼脂培育基中，混合均匀，放置己灭菌的直径为6 mm滤纸片，别离汲取提取液5 μL滴加于滤纸片上，以DMSO替代样品提取液作空白对照，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以氨苄青霉素作阳性对照，大肠杆菌、铜绿假单胞菌以硫酸卡那霉素作阳性对照。置37 ℃恒温箱培育16～24 h，调查细菌成长状况并丈量抑菌圈巨细。
2.5 抗植物病原真菌活性测定 在含有PDA培育基的平皿中心别离接入直径为4 mm的供试真菌菌饼，在菌饼四周均匀放置4片滤纸片，并在滤纸片上滴加5 μL提取液，以DMSO替代样品提取液作空白对照。置28 ℃恒温箱培育3～5 d，用十字丈量法记载菌饼成长直径，核算按捺率。
按捺率=（1-处理组纯成长量/对照组纯成长量） ×100%
3 成果
3.1 内生真菌外表消毒作用 经外表灭菌后不做任何处理的广藿香安排接种于相应的培育基中，恒温箱中培育3～5 d后，没有调查到任何真菌的成长，标明经过外表消毒后的样品，排除了其外表附生菌的影响，别离的菌株均来自植物安排内部。
3.2 内生真菌的别离判定 从广藿香根、茎、叶中别离得到72株内生真菌菌株（A593-A670），经ITS序列剖析判定为25属40种，别离菌株中断定到种的有36株；断定到属的有4株，别离为齿毛菌Cerrena sp. A593、多节孢Nodulisporium sp. A600、间座壳Diaporthe sp. A603、拟茎点霉Phomopsis sp. A604。菌株A641，A644与最类似物种的类似率较低，别离是95.0%，96.8%，为最类似种的参照种（表1）。
3.3 内生真菌的首要类群剖析 广藿香内生真菌的品种丰厚，但各类群的数量差异较大，其间拟茎点霉属、刺盘孢属和镰刀菌属为广藿香的优势种群，相对频率为12.5%，11.1%，11.1%，远远高于其他类群，其他类群的相对频率均低于8.5%。
广藿香内生真菌散布具有显着的安排特异性。从根中别离到5株内生真菌，占别离菌株总数的7%，分归于4个类群，包含镰刀菌属、茎点霉属、曲霉属和Acrocalymma属；从茎中别离到56株内生真菌，占别离菌株总数的78%，分归于20个类群，包含拟茎点霉属、刺盘孢属、镰刀菌属、棒孢菌属、间座壳属、小不整球壳属、毛壳属、弯孢属等，从叶中别离到11株内生真菌，占别离菌株总数的15%，分归于6个类群，包含曲霉属、毛壳属、弯孢属、原毛平革属、齿毛菌属、黑孢属（表2）。
3.4 抗细菌活性测定 72株内生真菌中有10个属20株真菌提取物至少对1种供试细菌有抗菌活性（抑菌圈直径≥8 mm），占别离菌株总数的27.8%，对2种供试细菌有按捺作用的活性菌株有14株，占别离菌株总数的19.4%。抗BS的活性菌株有18株，占别离总株数的25.0%，其间具有显着按捺活性（抑菌圈直径≥15 mm）的菌株有8株，别离是A593，A625，A611，A661，A654，A640，A606，A594；抗SA的活性菌株有16株，占分離总株数的22.2%，其间具有显着按捺活性的菌株有4株，别离是A593，A625，A594，A606；抗EC的活性菌株有2株，别离是A611，A625。一切内生真菌的提取物对铜绿假单胞菌均没有按捺作用（表3）。
3.5 抗植物病原真菌活性測定 72株内生真菌中共有14个属31株真菌提取物至少对1种供试病原真菌有按捺作用（按捺率≥50%以上），占别离菌株总数的43.1%，其间对一切供试病原真菌都有按捺作用的菌株有4株，别离是A607，A633，A643，A663；抗PL活性显着（按捺率≥95%以上）的菌株有6株，别离是A593，A625，A654，A616，A661，A663；抗CL，CS活性显着（按捺率≥80%以上）的菌株别离有2株，1株，别离是A607，A643，A633（表4）。
4 评论
本研讨从广藿香根、茎、叶中别离取得72株内生真菌，经ITS序列剖析判定为25个属40个分类单元，其间拟茎点霉属、刺盘孢属和镰刀菌属为优势菌群，并且这些内生真菌在广藿香不同安排中的散布存在显着的安排特异性，其间茎中内生真菌类群最为丰厚，叶和根中别离的内生真菌类群较少。经过活性测验发现广藿香内生真菌拟茎点霉、镰刀菌、曲霉菌具有显着的抗菌活性，为进一步开掘活性次级代谢产品供给了理论依据。
拟点茎霉是常见的植物内生真菌，能发生多种活性代谢产品。Wagenaar等[12]从薄荷Mentha haplocalyx中别离到的拟茎点霉属内生真菌能发生一种具有临床使用远景的新抗生素dicerandorls；Silva等[13]从美丽决明Cassia spectabilis的内生真菌P. cassiae发酵液中得到的杜松烷倍半萜类化合物3，11，12-trihydroxycadalene对球孢枝孢Cladosporium sphaerospermum和枝状枝孢C. cladosporioides具有显着的按捺活性。镰刀菌也是常见的植物内生真菌，该属内生真菌发生的代谢产品对病原菌具有按捺作用。如邵志宇等[14]从互花米草Spartina alterniflora内生真菌Fusarium sp. F4中别离得到的白僵菌素Ⅲ对结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis的MIC为5 mg·L-1；刘兆迪等[15]从药用植物三尖杉Cephalotaxus fortunei中别离得到的内生真菌F. tricinctum对B. subtilis，E. coli，Salmonella typhl具有显着的按捺作用。曲霉是别离频率很高的一类内生真菌，能发生具有抗菌活性的代谢产品。Liu等[16]从狗牙根Cynodon dactylon内生真菌A. fumigatus中别离到的asperfumid具有抗白色念珠菌活性，其MIC为75 μg·L-1；周凤等[16]从黄芪内生真菌Aspergillus sp.中别离到的cyclotryprostatins B对B. subtilis，E.coli的MIC值均为1 mg·L-1。
植物内生真菌不光能够发生重要的活性次级代谢产品，并且还能对药用植物挥发油成分发生重要影响。研讨标明，亚洲薄荷中的2种内生真菌对薄荷挥发油中的桉油素和氧化胡椒烯酮含量能发生显着性影响[17]，苍术中的3种内生真菌能改动苍术挥发油中4种首要活性成分苍术酮、苍术醇、β-桉叶醇及苍术素的相对百分含量[18]。本研讨别离取得的内生真菌还将为进一步展开广藿香植物内生真菌与其挥发油中成分的相关性研讨奠定了根底。
[参考文献]
[1] Saikkonen K，Wali P，Helander M，et al.Evolution of endophyte-plant symbioses[J].Trends Plant Sci， 2004， 9：275.
[2] Strobel G， Daisy B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2003， 67：491.
[3] 王永中， 肖亚中. 植物内生菌及其活性代谢产品[J]. 生物学杂志， 2004， 21（4）：1.
[4] 石瑛.内生真菌对植物成长发育的影响[J].现代农业科技，2010 （6）： 36.
[5] Gao X X， Zhou H， Xu D Y， et al. High diversity of endophytic fungi from the pharmaceutical plant， Heterosmilax japonica Kunth revealed by cultivation-independent approach[J]. FEMS Microbiol Lett， 2005， 249： 255.
[6] 王兴红. 内生真菌与天然产品研讨进展[J]. 中草药， 2007， 38（1）： 140.
[7] 我国药典. 一部[S]. 2015.
[8] Li Y C， Liang H C， Chen H M， et al. Anti-Candida albicans activity and pharmacokinetics of pogostone isolated from Pogostemonis Herba Phytomedicine[J]. Phytomedicine， 2012， 20：77.
[9] Park E J， Park H R， Lee J S， et al. Licochalcone A：an inducer of cell differentiation and cytotoxic agent from Pogostemon cablin[J]. Planta Med， 1998， 64（5）：464.
[10] Hussain A I， Anwar F， Iqbal T， et al. Antioxidant attributes of four Lamiaceae essential oils[J]. Pak J Bot， 2011， 43（2）：1315.
[11] Park H M， Park I K. Larvicidal activity of Amyris balsamifera， Daucus carota and Pogostemon cablin essential oils and their components against Culex pipiens pallens[J]. J Asia-Pac Entomol， 2012， 15：631.
[12] Wagenaar M M， Clardy J. Dicerandrols， new antibiotic and cytotoxic dimers produced by the fungus Phomopsis logicolla isolated from an endangered mint[J]. J Nat Prod， 2001， 64（8）：1009.
[13] Silva G H， Teles H L， Zanardi L M， et al. Cadinane sesquiterpenoids of Phomopsis cassia， an endophytic fungus associated with Cassia spectabilis （Leguminosae）[J]. Phytochemistry， 2006， 67：1964.
[14] 邵志宇， 馮永红， 邓云霞， 等. 互花米草内生真菌Fusarium sp. F4中的活性代谢物[J]. 我国天然药物， 2007， 5（2）：109.
[15] 刘兆迪， 解修超， 陈文强， 等. 药用植物三尖杉内生真菌的别离判定及抗菌活性[J]. 我国试验方剂学杂志， 2014， 20（9）：128.
[15] Liu J Y， Song Y C， Zhang Z， et al. Aspergillus fumigatus CY018， an endophytic fungus in Cynodon dactylon as a versatile producer of new and bioactive metabolites[J]. J Biotechnol， 2004， 114：279.
[16] 周凤， 张弘弛， 刘瑞， 等. 恒山黄芪内生真菌Aspergillus sp.代谢产品的别离和生物活性的测定[J]. 我国试验方剂学杂志， 2012， 18（4）：125.
[17] 郭晓恒. 薄荷内生真菌对薄荷成长及挥发油影响的研讨[D]. 成都：成都中医药大学， 2010.
[18] 张波， 戴传超， 方芳， 等. 三种内生真菌对茅苍术组培苗的成长及首要挥发油成分的影响[J]. 生态学杂志，2009， 28（4）：704.