桔梗皂苷D 三七总皂苷联合淫羊藿总黄酮改进D—gal致H9c2大鼠心肌细胞变老的维护效果
李靳+邓丽丽+周志勇+袁丁+张长城+王婷
[摘要]研讨三七總皂苷（total saponins of Panax notoginseng，TPNS）联合淫羊藿总黄酮（total flavonoids of epimedium，TFE）改进D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致H9c2大鼠心肌细胞变老的维护效果及或许机制。选用50 mol·L-1D-gal处理H9c2大鼠心肌细胞，以不同浓度TPNS单药、TFE单药、TPNS联合TFE预处理细胞4 h，D-gal影响H9c2心肌细胞24 h，MTT检测细胞活率进而断定协同效果最佳的联合计划；β-半乳糖苷酶染色法判定细胞变老程度；DCFH-DA探针检测细胞内活性氧（reactive oxgen species，ROS）水平；线粒体膜电位法（JC-1）检测线粒体膜电位改变状况；Western blot检测缄默沉静信息调理因子2相关酶类1（silentmating type information regulation 2 Homolog-1，SIRT1），过氧化物酶体激活物受体γ辅激活因子1α（peroxisomal proliferator-activated receptor-coactivator 1α，PGC-1α），缄默沉静信息调理因子2相关酶类3（silentmating type information regulation 2 homolog-3，SIRT3）蛋白表达状况。研讨标明TPNS（5 mg·L-1）联合TFE（5 mg·L-1）对H9c2心肌细胞增殖具有显着的协同效果（Q=1.154），因而断定其为协同效果最佳的联合计划；TPNS（5 mg·L-1）联合TFE（5 mg·L-1）显着下降β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数目和ROS荧光强度，显着进步线粒体膜电位和SIRT1，PGC-1α，SIRT3蛋白的表达量。TPNS（5 mg·L-1）联合TFE（5 mg·L-1）可发作改进D-gal致H9c2大鼠心肌细胞变老的维护效果，机制或许与调理SIRT1/PGC-1α和SIRT3信号通路，进而调控线粒体的功用和削减氧化应激损害有关。
[关键词]三七总皂苷； TFE； 变老
[Abstract]To investigate the protective effect of Panax notoginseng saponins combined with total flavonoids of epimedium on D-gal-induced senescence of H9c2 cells and explore its underlying mechanisms. The 50 mol·L-1D-gal was used to induce H9c2 cells senescence. Different concentrations of TPNS， TFE， and TPNS combined with TFE were used for 4 hours for pre-treatment. D-gal was used to stimulate H9c2 cardiac muscle cells for 24 h. Then in order to determine the best combined scheme， MTT was used to detect cell viability. Cell senescence was identified by β-galactosidase staining. Levels of reactive oxygen species（ROS） was observed by DCFH-DA detection. The changes of mitochondrial membrane potential were identified by JC-1 detection. Protein levels of silentmating type information regulation 2 Homolog-1（SIRT1）， peroxisomal proliferator-activated receptor-coactivator 1α（PGC-1α） and silentmating type information regulation 2 Homolog-3（SIRT3） were detected by western blot analysis. The results showed that TPNS（5 mg·L-1） combined with TFE（5 mg·L-1） had significant synergistic effect on H9c2 myocardial cell proliferation（Q=1.154）， so 5 mg·L-1TPNS combined with 5 mg·L-1 TFE was determined as the best scheme. The quantity of β-galactosidase staining and the fluorescence intensity of ROS were apparently decreased in 5 mg·L-1TPNS combined with 5 mg·L-1TFE scheme. Meanwhile， it markedly increased the florescence intensity of mitochondrial membrane potential and enhanced the protein expression of SIRT1， PGC-1α and SIRT3. TPNS combined with TFE could protect H9c2 cells from D-gal-induced senescence. The mechanism might be related to adjusting the signal pathways of SIRT1/PGC-1α， SIRT3， adjusting the structure and function of mitochondria and reducing oxidative stress injury.
[Key words]total saponins of Panax notoginseng； total flavonoids of epimedium； senescence
跟着年纪的添加，由心脏变老导致的心血管疾病接二连三，严重威胁患者的生命。心肌细胞是心脏发挥功用的首要细胞，研讨发现心肌细胞变老可导致心血管疾病[1]。心肌细胞变老的效果机制仍不清楚，因而寻觅推迟心肌细胞变老的有用药物对防治心血管疾病的发作开展具有重要含义。
三七总皂苷（total saponins of Panax notoginseng，TPNS）具有抗氧化应激的效果[2]。TPNS对H9c2大鼠心肌细胞变老具有维护效果[3]。TFE具有消除氧自由基，抗氧化应激等效果[4]， 淫羊藿总黄酮（total flavonoids of epimedium，TFE）可经过减轻氧化应激和削减细胞前期凋亡来对立H9c2大鼠心肌细胞变老[5]。但是，TPNS联合TFE对D-gal致H9c2大鼠心肌细胞变老的维护效果及机制研讨没有见国内（外）文献报导。因而本试验树立心肌细胞变老模型，评论TPNS联合TFE改进H9c2大鼠变老心肌细胞的维护效果及或许机制。
1 资料
1.1 细胞株 H9c2大鼠心肌细胞，购于我国科学院典型培育物保藏委员会细胞库。
1.2 药物与试剂 TPNS（购于成都植标化纯生物技能有限公司，质量分数>95%）；TFE（购于成都仁诚生物科技有限公司，质量分数80%）；D-gal（Sigma公司，1724619）；高糖DMEM（GIBCO公司，884684）；胎牛血清（GIBCO公司，10099141）；胰蛋白酶（GIBCO公司，EC2901）；细胞变老特异性-半乳糖苷酶原位染色试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司，GMS10012.1）；活性氧检测试剂盒（普利莱基因技能有限公司，C1300）；线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天生物技能研讨所，C2005）；SIRT3抗体（Millipore，2199719）；SIRT1抗体（Millipore，2465249）；β-actin（谷歌生物，GB13001）；PGC-1α（Santa Cruz，sc-13067）。
1.3 仪器 生物洁净工作台（姑苏安泰空气有限公司）；NU-4750E型二氧化碳培育箱（NuAire公司）；DMR型多功用显微镜及图画剖析体系（Syngne公司）；JA2003电子剖析天平（上海天平仪器厂）。
2 办法
2.1 细胞培育及给药 依据前期工作根底[2，4]，H9c2大鼠心肌细胞培育于DMEM培育基中（含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1、链霉素100 U·mL-1）。将培育瓶放于37 ℃，5%CO2无菌培育箱中，当H9c2大鼠心肌细胞长到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，接种于24或96孔板中，在培育箱中培育24 h，别离参加不同浓度TPNS单药、TFE单药、TPNS联合TFE培育H9c2大鼠心肌细胞4 h，再参加D-gal（50 mol·L-1）培育24 h。正常对照组细胞在相同条件下培育24 h后每隔12 h换液1次，D-半乳糖组细胞在相同环境下直接参加50 mol·L-1 D-gal影响24 h。
2.2 MTT法检测H9c2大鼠心肌细胞活率 H9c2大鼠心肌细胞悬液以5×103 个/mL接种于96孔板，每孔100 μL，设置10个组：①正常对照组；②D-半乳糖组（50 mol·L-1）；③TPNS单药组（5 mg·L-1）；④TPNS单药组（25 mg·L-1）；⑤TFE单药组（5 mg·L-1）；⑥TFE单药组（25 mg·L-1）；⑦TPNS（5 mg·L-1）联合TFE（5 mg·L-1）组；⑧TPNS（5 mg·L-1）联合TFE（25 mg·L-1）组；⑨TPNS（25 mg·L-1）联合TFE（5 mg·L-1）组；⑩TPNS（25 mg·L-1）联合TFE（25 mg·L-1）组。每个组设置6个复孔。药物效果24 h后弃去上清液，每孔参加终浓度为0.5 mg·L-1 MTT的培育基100 μL，培育4 h后，离心弃去上清液，每孔参加150 μL DMSO，震动10 min至结晶彻底溶解，当即放置在波善于490 nm的酶标仪中检测其吸光度A，確定协同效果最佳的计划。
2.3 β-半乳糖苷酶染色检测H9c2大鼠心肌细胞变老程度 H9c2大鼠心肌细胞悬液以1×105个/mL接种于24孔板中，每孔1 mL，依据MTT法断定的最佳联合计划，设置5个组：①正常对照组；②D-半乳糖组（50 mol·L-1）；③TPNS单药组（5 mg·L-1）；④TFE单药组（5 mg·L-1）；⑤TPNS（5 mg·L-1）联合TFE（5 mg·L-1）组，每孔设置6个复孔，效果24 h后，弃去上清液，每孔参加500 μL的整理液整理细胞外表，弃去整理液，每孔中参加500 μL的固定液，室温孵育5 min后，弃去固定液，每孔参加500 μL的酸性液清洗细胞外表，弃去酸性液，每孔参加400 μL提早预热的染色工作液， 37 ℃恒温箱孵育16 h，在100倍光学显微镜（视界50 μm）下调查细胞染成蓝色的状况。
2.4 DCFH-DA探针法检测H9c2大鼠心肌细胞内ROS荧光强度 H9c2大鼠心肌细胞悬液以1×105 个/mL接种于24孔板中，每孔1 mL，分组同2.3项下，每孔设置6个复孔，效果24 h后，弃去上清液，参加1 mL，10 μmol·L-1的DCFA-DA溶液，将其放入37 ℃恒温箱中孵育1 h，用不含FBS的DMEM小心肠将细胞清洗3遍，倒置荧光显微镜（100倍，视界50 μm）下调查荧光强度。
2.5 JC-1检测H9c2大鼠心肌细胞线粒体膜电位水平 H9c2大鼠心肌细胞悬液以1×105 个/mL接种于24孔板中，每孔1 mL，分组同2.3项下，每孔设置6个复孔，效果24 h后，弃去上清液，参加JC-1染色工作液，在37 ℃恒温相中孵育20 min后停止孵育，弃去工作液，用JC-1染色缓冲液清洗2遍后，弃去缓冲液，第3遍参加JC-1染色缓冲液，在倒置荧光显微镜（100倍，视界50 μm）下调查荧光强度。
2.6 蛋白免疫印迹检测SRIT1，PGC-1，SRIT3蛋白表达状况 H9c2大鼠心肌细胞悬液以5×105 个/mL接种于6孔板中，每孔2 mL，分组同2.3项下，每孔设置6个复孔，效果24 h后，搜集细胞，裂解细胞并提取总蛋白，依据BCA蛋白定量法检测各蛋白浓度，选用95 ℃灭活10 min，顺次进行电泳，转膜，关闭，一抗孵育，二抗孵育，选用凝胶成像体系进行检测。
2.7 统计学办法 蛋白免疫印迹图画选用Image J软件剖析，数据选用SPSS 16.0软件剖析，以±s标明，各组间数据比较选用t查验，P<0.05为差异具有统计学含义。
判别药物联合效果的性质选用金正均法核算Q值。Q=Ea+b/（Ea+Eb-Ea×Eb）进行核算，其间Ea+b为 A，B 2药合用时对细胞的功率，Ea为A药对细胞的功率，Eb为B药对细胞的功率；Q值<0.55为显着拮抗，0.55～ 0.85为拮抗，0.85～1.15为单纯相加，1.15～2.0为增强，>2.0为显着增强。
3 成果
3.1 TPNS联合TFE对变老H9c2大鼠心肌细胞活率的影响 与正常对照组比较，D-gal组细胞的活率显着下降（P<0.05）；与D-gal组比较，跟着TPNS和TFE浓度的添加，细胞活率逐步添加（P<0.05），而TPNS联合TFE对细胞活率的添加更为显着（P<0.05），与TPNS单药、TFE单药组比较，各联合用药组中细胞活率显着添加（P<0.05），且各联合用药具有相加或许协同效果，其间TPNS 5 mg·L-1联合TFE 5 mg·L-1协同效果最好（Q=1.154），因而挑选TPNS 5 mg·L-1联合 TFE 5 mg·L-1组为最佳联合计划，见表1。
3.2 TPNS联合TFE对变老H9c2大鼠心肌细胞内β-半乳糖苷酶活性的影响 与正常对照组比较，D-gal组中很多的H9c2大鼠心肌细胞被染成蓝色，与D-gal组比较，5 mg·L-1 TPNS单剂量组、5 mg·L-1TFE单剂量组中被染成蓝色的H9c2大鼠心肌细胞数量削减，与D-gal 组、5 mg·L-1TPNS单剂量组及5 mg·L-1TFE单剂量比较，5 mg·L-1TPNS联合5 mg·L-1TFE组中被染成蓝色的H9c2大鼠心肌细胞数量显着削减，见图1。
3.3 TPNS联合TFE对变老H9c2大鼠心肌细胞内ROS的影响 与正常对照组比较，D-gal组中ROS的荧光强度显着增强，与D-gal组比较，5 mg·L-1TPNS单剂量组及5 mg·L-1TFE单剂量组中ROS的荧光强度均下降，与D-gal 组、5 mg·L-1TPNS单剂量组及5 mg·L-1TFE单剂量比较，5 mg·L-1TPNS联合5 mg·L-1TFE组中ROS的荧光强度显着下降。见图2。
3.4 TPNS联合TFE对变老H9c2大鼠心肌细胞内线粒体膜电位的影响 与正常对照组比较，D-gal组中绿色荧光强度增强，而赤色荧光弱小；与D-gal组比较，5 mg·L-1TPNS单剂量组以及5 mg·L-1TFE单剂量组中赤色荧光增强而绿色荧光削弱，与D-gal组、5 mg·L-1TPNS单剂量组以及5 mg·L-1TFE單剂量比较，赤色荧光显着增强，绿色荧光显着削弱。见图3。
3.5 TPNS联合TFE对变老H9c2心肌细胞内SIRT1，PGC-1α，SIRT3蛋白表达量的影响 与正常对照组比较，D-gal组中，SIRT1，PGC-1α以及SIRT3蛋白表达量显着下降（P<0.05）；与D-gal组比较，5 mg·L-1TPNS单剂量组以及5 mg·L-1TFE单剂量组中SIRT1，PGC-1α以及SIRT3蛋白表达量添加（P<0.05）；与D-半乳糖组，5 mg·L-1TPNS单剂量组以及5 mg·L-1TFE单剂量组比较，5 mg·L-1TPNS联合5 mg·L-1TFE组中SIRT1，PGC-1α，SIRT3蛋白表达量显着添加（P<0.05）。见图4。
4 评论
中医理论以为，变老是由肾虚血瘀导致[6]。《难经》云：“肾者，原气之所系”。《医林改错》云：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气必逗留而为瘀。血府，血之底子，瘀则殒命”。提示肾虚必定导致血瘀，血瘀是促进变老的重要因素之一。因而将补肾与活血有机结合起来组成补肾活血方改进肾虚血瘀的状况进而推迟变老。
心脏变老是导致心功用阑珊和各种心血管疾病的首要因素，中医理论以为，肾中精气虚衰必定导致心脏功用阑珊[7]。因而肾虚血瘀是导致心脏变老的首要原因之一，补肾活血方是防治心脏变老的根本治则。现代研讨显现，补肾中药经过调理线粒体结构与功用进而推迟心脏变老[8]。
淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物，《本草纲目》云：“淫羊藿，益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”。TFE是淫羊藿的首要成分。现代研讨标明：TFE具有补肾壮阳、推迟变老的药理效果[9]。三七为五加科多年生草本植物，《医学衷中参西录》云：“三七，善化瘀血，为吐衄要药”。提示三七具有活血化瘀之成效。TPNS是三七首要成分，與三七生药比较，药效杰出。胡志洁研讨成果显现TPNS具有按捺动脉硬化，防治心肌缺血，降血脂的功用[10]。因而TPNS与TFE相结合组成补肾活血方推迟变老。本试验成果显现，与D-gal 组、TPNS单剂量组以及TFE单剂量比较，5 mg·L-1TPNS联合5 mg·L-1TFE细胞活率显着且协同效果最佳。
线粒体是真核细胞生物氧化和能量转化的首要场所，线粒体亦是发作活性氧（ROS）的首要场所。大部分研讨者认可 “自由基与线粒体变老理论”。线粒体在病理条件下，电子传递呈现妨碍，导致线粒体内ROS添加，进一步损害线粒体膜以及mtDNA等，构成恶性循环，然后导致线粒体变老[11]。心脏是耗能最多的器官之一，因而心脏中含有很多的线粒体。新近研讨标明：线粒体结构与功用损害及ROS添加是导致心脏变老的重要原因之一[12]。Escobales N等[13]研讨标明线粒体靶向活性氧铲除剂：XJB-5-131有用下降变老大鼠心脏线粒体中ROS含量，一起进步线粒体膜电位水平进而改进因为变老引起的心血管疾病。Baris O R等 [14]研讨显现老龄大鼠心肌线粒体内膜通透性添加、线粒体肿胀、呼吸链功用减退及氧化磷酸化脱偶联。前期研讨标明TPNS显着下降变老H9c2大鼠心肌细胞内ROS的荧光强度[3]，显着添加线粒体膜电位水平[15]。TFE经过抗氧化应激改进D-gal致H9c2大鼠心肌细胞变老[5]。本试验成果标明TPNS联合TFE能有用铲除变老H9c2大鼠心肌细胞内过多的ROS，显着升高线粒体膜电位水平。提示，TPNS联合TFE推迟H9c2大鼠心肌细胞变老，或许与其减轻氧化应激和调理线粒体结构与功用有关。
研讨标明SIRT1/PGC-1α通路与线粒体功用有亲近的联络[17-18]。SIRT1去乙酰化线粒体内多种转录因子如PGC-1α，p53等，促进线粒体发作[19]。PGC-1α是线粒体发作的首要调理因子，其能调控心肌氧化程度[20]。白藜芦醇（SIRT1激动剂）可经过诱导细胞激活SIRT1/PGC-1α信号通路，以促进线粒体生物组成进而推迟细胞变老[21]。变老小鼠高表达SIRT1时，进步PGC-1α表达，能有用防治心肌肥厚，按捺心肌细胞凋亡[22]。前期研讨成果显现TPNS[9]、TFE或许经过调理线粒体SIRT1/PGC-1α途径改进线粒体功用。本试验研讨成果标明TPNS联合TFE可显着升高SIRT1/PGC-1α蛋白表达水平。
研讨标明SIRT3与线粒体结构与功用有着亲近的联络[23]。小分子SIRT3仅存在于心肌细胞的线粒体中，SIRT3对能量生成、代谢、细胞凋亡及线粒体自由基发作起到很重要效果[24]。Chen Y等[25]研讨发现SIRT3能够经过上调线粒体内Mn-SOD的表达，进而进步线粒体铲除ROS才能。Sundaresan N R等[26]研讨发现SIRT3表达缺点小鼠在第8周呈现心肌肥壮、纤维化等心脏变老体现。本试验研讨标明TPNS联合TFE能显着进步SIRT3蛋白表达水平。提示，TPNS联合TFE或许经过调理SIRT3信号通路进而调理线粒体结构与功用。
综上所述，TPNS联合TFE对D-gal致H9c2大鼠心肌细胞变老具有维护效果，这种效果或许与调理SIRT1/PGC-1α，SIRT3信号通路，进而调理线粒体功用和减轻氧化应激有关。
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[责任编辑 张宁宁]