硫利达嗪 硫利达嗪联合氯雷他定按捺胃肠道肿瘤效果的研讨
张金梅++康文全++靳广毅++陈婷婷
[摘要]意图 开端评论神经系统药物对胃肠道肿瘤的作用。办法 选取硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱、多巴胺、乙酰胆碱、舒乐安靖6种经典的神经系统药物，运用CCK-8法，从0.01、0.1、1、10、100 μmol/L不同浓度梯度别离检测其对胃肠道肿瘤体外的活性。并以小鼠脾脏淋巴细胞为模型，研讨神经系统药物在体外对免疫细胞的安全性。成果 6种经典的神经系统药物中，100 μmol/L东莨菪碱、100 μmol/L氯雷他定和10 μmol/L硫利达嗪对人结肠癌和人胃癌细胞发作毒性（均P<0.05），而且以硫利达嗪和氯雷他定的组合最为有用。6种神经系统药物仅对肿瘤细胞起到杀伤的作用，而对正常小鼠的脾淋巴细胞无毒性。10 μmol/L硫利达嗪联合25 μmol/L氯雷他定体外按捺鼠源结肠癌细胞和鼠源胃癌细胞。定论 硫利达嗪联合氯雷他定在体外能够有用地进步抗胃肠道肿瘤作用，为进一步联合医治供给新战略。
[关键词]硫利达嗪；氯雷他定；神经系统药物；胃肠道肿瘤；联合医治
[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（c）-0004-05
[Abstract]Objective To discuss the preliminary effect of nervous system drugs on gastrointestinal tumors.Methods Thioridazine，Loratadine，Scopolamine，Dopamine，Acetylcholine and Estazolamum （0.01，0.1，1，10，100 μmol/L），six classical nervous system drugs were selected to detect the activities of gastrointestinal tumor in vitro by using CCK-8 assay.The spleen cells of mice were also used as the model to study the safety of the nervous system drugs in vitro.Results Among six classical nervous system drugs，cell growth on human colon and gastric cancer clells were suppressed by 100 μmol/L scopolamine，100 μmol/L Loratadine and 10 μmol/L Thioridazine （P<0.05），especially the combination of Thioridazine and Loratadine.Six drugs only played roles in killing tumors cells，while the spleen lymphocytes of normal mice were non-toxic.The growth of mouse gastrointestinal carcinoma cells in vitro were inhibited by 10 μmol/L thioridazine and 25 μmol/L Loratadine.Conclusion Thioridazine combined with Loratadine is proved to enhance anti-gastrointestinal tumor effects in vitro，and provides a new strategy for forward combination treatment.
[Key words]Thioridazine；Loratadine；Nervous system drugs；Gastrointestinal tumor；Combination therapy
中國肿瘤挂号中心发布的《2013年我国肿瘤挂号年报》数据显现，我国死亡率最高的7种癌症中与消化系统有关的癌症就占了5种：肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌和胰腺癌。因而，知道及研讨消化系统癌症的发病机制，进步肿瘤的医治技能刻不容缓。传统的医治办法有手术、化疗、放疗，可是这些办法常常无法消除一切的肿瘤细胞，有用率低。因而，联合药物肿瘤疗法可能为胃肠道肿瘤的医治供给一种新的视角[1]。
2015年1月20日，美国临床肿瘤学会（ASCO）发布了《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学开展》，在“十年回忆”中说到肿瘤患者的生计和存活质量在曩昔的十年内显着改进，其间就有1项发现是联合医治战略有用地延伸脑肿瘤和前列腺癌患者的生计期[2]。因为肿瘤高度的异质性、多样性不只存在于不同的肿瘤和不同的患者之间，也存在于同一个肿瘤内。所以，单一的医治办法现已很难一起战胜肿瘤的异质性和各类免疫按捺机制。从神经系统药物自身的神经维护效应来看，一线化疗药物联合神经药物医治胃肠道肿瘤，能够避免化疗药对患者神经的毒性，促进药效更趋向于安全的方向开展。现在国际上提出许多联合医治计划，可是，神经系统药物联合医治进步抗肿瘤的疗法，作为医治胃肠道肿瘤的一种新的医治战略没有见报导。因而，运用神经系统药物调控消化系统癌症在医治恶性肿瘤方面具有理论立异含义。鉴于以上研讨开展，本课题选取了神经系统中几个经典的药物，经过检测其对胃肠道肿瘤体外的活性，然后为胃肠道肿瘤医治的开展供给新战略。
1目标与办法
1.1目标
试验用Balb/c雌性小鼠，体重（16±20）g，4～6周龄，购自广东省医学动物试验中心。人结肠癌细胞（HCT116）、小鼠结肠癌细胞（CT26.WT）和人胃癌细胞（SGC7901）、小鼠胃癌细胞（MFC）均购自我国科学院上海生科院细胞资源中心。其他首要试验试剂见表1。
1.2试验办法
1.2.1细胞培育 人结肠癌细胞（HCT116）、小鼠结肠癌细胞（CT26.WT）和人胃癌细胞（SGC7901）、小鼠胃癌细胞（MFC）均用含10%胎牛血清、青霉素（100 μg/ml）和链霉素（100 μg/ml）的DMEM培育液，置于37℃、5% CO2培育箱中培育，试验所用的细胞处于对数成长期。
1.2.2 CCK-8剖析 在96孔板中制造100 μl的细胞悬液，每孔约1×104个细胞，将培育板在培育箱预培育24 h（37℃，5%CO2），向培育板参加不同浓度的多巴胺（Dopamine）、硫利达嗪（Thioridazine）、氯雷他定（Loratadine）、乙酰胆碱（Acetylcholine）、东莨菪碱（Scopolamine）、舒乐安靖（Estazolamum）单药，或许这6种神经系统药物2、3种药物联合，处理24 h之后，向每孔参加10 μl的CCK-8溶液，将培育板在培育箱内孵育1～4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
1.2.3检测神经系统药物对人结肠癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）细胞增殖及细胞活率的影响 选取不同浓度（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）多巴胺、硫利达嗪、氯雷他定、乙酰胆碱、东莨菪碱、舒乐安靖，运用CCK-8检测试剂别离检测对人结肠癌（HCT116）和人胃癌细胞（SGC7901）增殖及细胞活率的影响。
1.2.4检测神经系统药物对小鼠免疫细胞活率的影响
1.2.5硫利达嗪、氯雷他定、舒乐安靖、东莨菪碱4种药物不同摆放組合 硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱、舒乐安靖4种药物进行一系列不同组合（表2），每种药物10 μmol/L。运用CCK-8检测试剂别离检测不同组合的神经系统药物对人结肠癌和人胃癌细胞活率的影响。
1.2.6调查两种药物联合运用的协同作用 选用联合作用指数（CI）判别两种药物的协同性，CI=AB/（A×B），A、B代表两种不同药物的吸光度。CI<1为协同作用；CI=1为叠加效应；CI>1为拮抗作用。
1.3统计学办法
选用Graphpad Prism 5软件进行统计学剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，两组间比较选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1神经系统药物对体外胃肠道肿瘤细胞活率的影响
运用CCK-8别离检测不同浓度（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）多巴胺、硫利达嗪、氯雷他定、乙酰胆碱、东莨菪碱、舒乐安靖这6种神经系统药物对人结肠癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）细胞增殖及细胞活率的影响。试验成果如图1所示，多巴胺、乙酰胆碱和舒乐安靖与对照组比较，差异无统计学含义（P>0.05），东莨菪碱和氯雷他定从100 μmol/L开端明显按捺肿瘤细胞的活率（P<0.01），硫利达嗪从10 μmol/L开端对肿瘤细胞发作毒性（P<0.01）（图1）。
2.2神经系统药物对小鼠免疫细胞活率的影响
以小鼠脾脏淋巴细胞为模型，研讨神经系统药物在体外对免疫细胞的安全性，成果发现6种神经系统药物对小鼠脾淋巴细胞的活率基本无影响，而且100 μmol/L的多巴胺或东莨菪碱能够促进淋巴细胞的增殖（P<0.01）（图2）。提示神经系统药物仅对肿瘤细胞起到杀伤的作用，而对正常小鼠的脾淋巴细胞无毒性。
2.3神经系统药物联合作用对胃肠道肿瘤细胞活率的影响
选取对人结肠癌细胞活率和人胃癌细胞活率发作按捺作用的硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱这3种药物与无肿瘤细胞活率按捺作用的舒乐安靖进行一系列不同组合，每种药物10 μmol/L，作用于人结肠癌（HCT116）细胞和人胃癌（SGC7901）细胞。成果发现，但凡有硫利达嗪参加的组合（Group 1、2、3、5、7、9）都会明显按捺肿瘤细胞的活率（P<0.01），而且以Group 9的硫利达嗪和氯雷他定的组合最为有用（图3）。
2.4硫利达嗪和氯雷他定联合抗肿瘤作用
运用鼠源的结肠癌细胞（CT26.WT）和鼠源胃癌细胞（MFC），将硫利达嗪（THZ）和氯雷他定（LOR）的研讨浓度进一步缩小规模，别离为1、5、10、25、50、75 μmol/L。在给药24 h之后，运用CCK-8检测试剂检测到，两种药物按捺肿瘤的活率呈浓度梯度的办法，而且硫利达嗪从10 μmol/L开端明显按捺肿瘤成长（P<0.01）；氯雷他定从25 μmol/L开端按捺人结肠癌细胞（HCT116）成长（P<0.01），50 μmol/L开端明显按捺人结肠癌细胞成长（P<0.01）；氯雷他定从50 μmol/L开端明显按捺人胃癌细胞（MFC）成长（P<0.01）（图4）。
为了进一步清晰硫利达嗪和氯雷他定潜在的联合抗肿瘤效应，将10 μmol/L硫利达嗪别离与25、50、75 μmol/L氯雷他定进行不同的组合（图4），运用CI指数公式，能够得出，10 μmol/L硫利达嗪与25 μmol/L氯雷他定联用的组合，CI<1（小鼠结肠癌细胞CT26.WT CI=0.78；小鼠胃癌细胞MFC CI=0.55），呈协同作用，为最适组合浓度。
3评论
多巴胺是儿茶酚胺类宗族重要的神经递质，首要在中枢神经系统和胃肠道内组成[3]，经过靶向细胞外表特异的受体而行使它的首要功能。多巴胺受体广泛散布于大脑、心脏、肾脏、血管、肾上腺皮质以及交感神经结尾。它包括5个亚型，分为两大类：一个是D1样受体（D1R，D1和D5），一个是D2样受体（D2R，D2、D3和D4），都隶属于G蛋白偶联受体的超级宗族。多巴胺两种类型的受体具有相似的序列，可是具有不同的药理学特性，D1样受体激活后升高细胞内cAMP水平，而D2样受体宗族激活后下降细胞内cAMP水平[4]。越来越多的研讨标明多巴胺能够经过按捺肿瘤内皮细胞上的血管表皮成长因子（VEGF-R2）的磷酸化活性，然后遏止肿瘤安排血管的成长而用于调控肿瘤的开展[5]。而且多巴胺经过激活D2样受体而按捺肿瘤细胞的成长[6-7]。D2R敲除的小鼠表现出血管生成增多、肿瘤成长以及VEGF-R2磷酸化[8]。在乳腺癌以及结肠癌细胞模型中，D2R激动剂增强抗癌药物的有用性，可是多巴胺自身并没有按捺乳腺癌及结肠癌的细胞增殖和搬运[9]。许多研讨将多巴胺与广谱的抗癌药阿霉素联合来医治乳腺癌，成功下降了肿瘤的体积，添加了生计期[9]。相同在人的结肠癌中，多巴胺联合5-氟尿嘧啶也调查到相似的成果。研讨标明，多巴胺经过DRD1受体来按捺CD4+和CD8+的T细胞的增殖和毒性[10]，DRD1拮抗剂SCH23390阻断DRD1受体通路后，小鼠淋巴细胞IL-4表达下降、IFN-γ表达增高[11]，而且按捺了肿瘤的成长和微管的密度[12]。
硫利达嗪经过靶向大脑中的多巴胺受体，来医治精力类疾病。2012年Cell杂志上发布，硫利达嗪经过靶向DRD2受体，成功消除了人体的癌症干细胞以及白血病细胞，而不会对正常的细胞发作副作用[13]。
抗组胺剂或对某些肿瘤的癌症具有抗癌成效。氯雷他定首要医治缓解过敏性皮肤病或过敏性鼻炎等症状及体征。经过拮抗H1受体，对中枢神经系统有按捺和麻醉的作用，所以也用于辅佐医治某些精力病。有研讨标明氯雷他定的活性代谢物地氯雷他定能够经过按捺STAT3和c-Myc的活性而诱导皮肤T细胞淋巴瘤的凋亡[14]。相同该拮抗剂也在肿瘤肥大细胞[15]、在结肠癌中经过激活Chk1添加细胞周期中的G2/M期按捺肿瘤成长[16]。
乙酰胆碱在保持认识的清醒、学习回忆认知等活动中起到重要作用。研讨运用α7型烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂能够避免肺癌的发作开展[17]。可是关于乙酰胆碱受体拮抗剂东莨菪碱作用于胃肠道肿瘤的报导极为罕见。
在本研讨中，选取了多巴胺、硫利达嗪、氯雷他定、乙酰胆碱、东莨菪碱、舒乐安靖这6种经典的神经系统药物别离检测体外对人结肠癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）细胞增殖及活率的影响，而且检测对小鼠脾淋巴细胞活率的影响，成果发现这6种神经系统药物均对正常鼠的脾淋巴细胞无毒性，充分说明其抗肿瘤作用的安全性，且在6种药物中只要东莨菪碱、氯雷他定和硫利达嗪对胃肠肿瘤细胞在体外有按捺作用。接下来，将具有体外抗肿瘤作用的药物硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱加上舒乐安靖4种药物进行不同组合进一步研讨联合抗肿瘤作用，成果发现硫利达嗪和氯雷他定的联合处理，在体外按捺胃肠道肿瘤细胞成长最为有用。
当评价肿瘤成长的按捺水平常，只要相对高的浓度，10 μmol/L的硫利达嗪或许50 μmol/L的氯雷他定独自运用时能够对小鼠结肠癌细胞（CT26.WT）和小鼠胃癌细胞（MFC）显现出细胞毒性。但是，10 μmol/L的硫利达嗪与25 μmol/L的氯雷他定在鼠源的结肠癌细胞（CT26.WT）的CI值为0.78，鼠源胃癌细胞（MFC）的CI值为0.55，均小于1，显现出了协同效应。根据以上成果，发现硫利达嗪与氯雷他定组合的最适浓度，为下一步研讨神经系统药物联合化疗药物医治胃肠道肿瘤进而进步抗肿瘤的作用奠定根底。
因为单药医治癌症的功率有限，因而越来越多的依据标明，联合疗法能够添加任何单一药物的有用性。硫利达嗪，一个被广泛用于医治精力疾病的药物，已有报导显现能够选择性的靶向白血病肿瘤干细胞[13]，而且在卵巢癌移植瘤中，经过按捺VEGFR-2/PI3K/mTOR的信号通路，起到按捺血管生成的作用[18]。硫利达嗪联合多柔吡星能够增强抗癌药物多柔吡星在多药耐药肿瘤细胞内的浓度，而到达更好的抗癌作用[19]。氯雷他定，一种全世界广泛用于口服的抗组胺剂，也有报导显现经过G2/M期细胞周期阻滞，起到抗肿瘤的效应[20]。
此次研讨初次提醒了硫利达嗪和氯雷他定联合应用在体外显现出更有用的抗胃肠癌的效应，为进一步研讨神经系统药物对胃肠道肿瘤的调控机制及与化疗药物联用进步抗肿瘤作用奠定了根底，而且为胃肠道肿瘤的医治办法供给了一种潜在战略。
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（收稿日期：2017-03-13 本文編辑：任 念）